Система интенсивных технологий производства винограда в северной зоне промышленного виноградарства РФ — Процесс оздоровления и клонального микроразмножения

Процесс оздоровления и клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа

Первым этапомявляется отбор эксплантов и введение их в культуру. Морфогенетический потенциал экспланта по массовому формированию побегов и их укоренению зависит от его происхождения. Меристемные ткани, вычлененные из центральных побегов и почек, формируют растений на 15-20% больше чем из боковых почек. Более высокая регенерационная способность у тканей из 5-6, затем 7-8 и 9-10 узла побега, слабее всего развиваются ткани из 1-2 узла побега, считая от его верхушки.

Экспланты большинства сортов винограда характеризуются наиболее высокой регенерационной способностью при взятии их в фазу активного роста, а самой низкой — в конце вегетации.

Широко используются в качестве исходного материала зеленые побеги, взятые с вегетирующих кустов винограда, выращенные в лаборатории из вызревшей лозы; а также почки вызревших и невызревших побегов, из которых вычленяют меристематические ткани.

На первом этапе необходимо добиться хорошо растущей стерильной культуры. Это осуществляется путем стерилизации растительных тканей ртутьсодержащими (сулема или диацид, 0,1-0,2%) или хлорсодержащими (хлорамин 10-15%, гипохлорит натрия или кальция 5-10%) растворами в течение 10-30 минут. После этого растительные ткани необходимо тщательно промыть в трех порциях стерильной дистиллированной воды и перенести на приготовленную заранее питательную стерильную среду, разлитую в стерильные пробирки. Как правило, эта питательная среда содержит минеральные соли по рецепту Мурасиге и Скуга, а также биологически активные вещества и стимуляторы роста.

Повышения приживаемости меристем можно достигнуть, изменив состав питательной среды: уменьшить до 3/4 состав макроэлементов и добавить 170 мг/л КН₂РО₄. Этап ввода необходимо разделить на два подэтапа. Культивирование следует осуществлять сначала на твердой питательной среде. Затем, через 3-4 недели, когда меристемы увеличатся до 2-3 мм, пересадить их на жидкую питательную среду на косые мостики из фильтровальной бумаги, а пробирки поместить на вращающийся аппарат роллерного типа с тем, чтобы экспланты все время омывались питательной средой. Оптимальное содержание цитокинина 6–БАП для большинства сортов винограда, как в твердой, так и в жидкой питательной среде составляет 1,0 мг/л.

Для повышения регенерационной способности меристем разработан способ комбинированной обработки их электромагнитным полем (ЭМИ) сверхвысокой чистоты (СВЧ- лучи) и узкополосным лазером. Способ основан на модификации и изменении проницаемости клеточных мембран под действием лучей СВЧ, что приводит к усилению притока питательных веществ, воды и кислорода и активизирует ферментные системы обмена веществ. При облучении меристем в течение 75 минут возрастает средний и максимальный размер меристем, уменьшается их гибель от некроза, увеличивается число срезанных микро побегов в расчете на одну выделенную меристему с 0,8 в контроле до 4,4шт., то есть регенерационная способность меристем возрастает в 5,5 раза.

При добавлении в питательную среду препарата эмистим, благодаря его широкому спектру действия, происходит улучшение приживаемости меристем на обоих этапах ввода. Улучшается пролиферация: новообразование узлов и побегов, срезка побегов для укоренения и дальнейшего микроразмножения. Так у сорта Дружба приживаемость меристем на первом этапе возросла с 56,1 до 81,2% , на втором этапе с 39,0 до 46,8%, продуктивная регенерация возросла в 3,5 раза.

Второй этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов. Культивирование проводят на жидкой питательной среде Мурасиге и Скуга в колбах Эрленмейера. Тонкий слой питательной среды (2-4мм), в зависимости от размера экспланта, обеспечивает достаточную аэрацию. Добавление в питательную среду цитокинина 6-БАП в первом пассаже-1,0мг/л, со второго пассажа-2,0мг/л индуцирует развитие многочисленных пазушных побегов. Пересадки осуществляют через 14 дней, каждый раз, разделяя эксплант на 5-7 частей и снова повторно высаживая, на свежую питательную среду того же состава для повторения цикла размножения.

Разработан состав питательной среды для этапа собственно микроразмножения труднопролиферирующих сортов винограда. Увеличение содержания 6-БАП, ГК₃,удвоение содержания Fe-хелат в среде Мурасига-Скуга способствует повышению регенерационной способности меристем в 3 раза.

Третий этап – укоренение полученных микропобегов осуществляют на жидкой питательной среде Мурасиге и Скуга с уменьшенным содержанием (1/4) макроэлементов, сахарозы (10 г/л) + 0,1 мг/л ИУК или эта среда без ИУК, но с предварительной обработкой базальных концов побегов 0,1 мг/л.

Четвертый этап – микрочеренкование, полученные побеги с 8-10-ью узлами разделяют на однопочковые микрочеренки, которые используются в качестве вторичных эксплантов. Оптимальной средой на этапе микрочеренкования является питательная среда Мурасиге и Скуга, преимущество которой доказано в сравнении со средой Хеллера и Готре. При продолжительном культивировании ризогенная зона и надземная часть пробирочных растений лучше развиваются на модифицированной среде Мурасиге и Скуга с уменьшенным количеством микроэлементов. Уменьшение содержания ИУК в питательной среде до 0,1 мг/л обеспечивает улучшение приживаемости микрочеренков, соотношения между развитием у растений ризогенной зоны и надземной части (коэффициент полярности), образование большего числа листьев, а также лучшее развитие растений при субкультивировании.