Взаимодействие микроорганизмов и растений


Взаимодействие микроорганизмов и растений

 

Взаимодействие микроорганизмов с растениями можно классифицировать по различным типам взаимодействия от паразитизма до симбиоза. Ярким проявлением симбиоза является взаимовыгодное взаимодействие между бобовыми и некоторыми другими группами растений и азотфиксирующими микроорганизмами. Важно отметить, что взаимно полезное взаимодействие наблюдается между растениями и микроорганизмами, способствующими переходу фосфора в доступное для растений состояние и обеспечивающих минеральное питание другими элементами.

Азотфиксация микроорганизмами

Среди элементов минерального питания, необходимых растениям в достаточно больших количествах, но находящихся в малодоступном состоянии выделяются азот, фосфор и калий, обычно обозначаемые в агрономии как NPK. В естественных ценозах, при наличии абиогенных факторов развития важную роль в переводе этих элементов в состояние, доступное для растений, играют микроорганизмы. Основной пул азота находится в атмосфере, а фосфор и калий содержатся в практически нерастворимом состоянии в земной коре. Обычно, если речь идет о биологической фиксации азота, говорят о симбиозе клубеньковых микроорганизмов и корней бобовых растений. Однако биофиксаторы азота распространены в разных средах, как в симбиозе с растительными организмами, так и в свободном состоянии.

В земной коре общее содержание азота (молекулярного и в виде соединений) достигает всего 0,04% (по массе). Основная масса азота на Земле находится в атмосферном воздухе; 78% воздуха – это чистый молекулярный азот. В количественном выражении это составляет 4*1015 т. Ни человек, ни животные, ни растения не могут потреблять молекулярный азот, которым изобилует воздушный океан. Как отмечает В. Шильникова — столб воздуха над одним гектаром земной поверхности содержит 80 000 т азота, в энциклопедии приводится величина в 70 000 тсвободного азота, в любом случае это настолько значительная величина, так если бы растения могли его усваивать, этого запаса было бы достаточно для получения 30 ц зерновых с 1 га в течение более полумиллиона лет. Однако растениям нужен азот минеральных соединений, и, несмотря на обилие молекулярного азота, они могут испытывать «азотный голод».

Содержание доступного растениям азота в почве обычно невелико. Поэтому повышение урожайности сельскохозяйственных растений связано в первую очередь с улучшением их азотного питания. По примерным подсчетам на 70-е годы прошлого века, для сельскохозяйственной продукции земного шара было необходимо ежегодно около 100 — 110 млн. т азота, но с минеральными удобрениями вносилось лишь около 30% азота. Как было показано выше, в настоящее время потребление азота начало достигать величин достаточных 40 лет назад.

Существуют две группы микроорганизмов фиксирующих атмосферный азот. Одна из них находится в симбиозе с высшими растениями, образуя клубеньки на корнях. К этой группе относятся клубеньковые бактерии. Микроорганизмы другой группы обитают в почве независимо от растений. К ним относятся азотобактер, клостридиум, бейеринкия и другие свободноживущие микроорганизмы. Потенциальные возможности симбиотических азотфиксаторов, в переводе азота в связанное состояние, значительно выше, чем свободноживущих. Некоторые азотфиксаторы показаны на рисунке 22.

clip_image002

1 — Azotobacter vinelandii; 2 — Clostridium pasterianum; 3 — Rhizobium meliloti; 4 — клубеньковые бактерии в клетках корня ольхи.

Рисунок 22 — Азотфиксирующие микроорганизмы

Открытие азотфиксирующих бактерий

Проблема биологического азота возникла с развитием земледельческой культуры. Издавна из практической агрономической деятельности человека было известно, что бобовые растения повышают плодородие почвы. Еще в III — I вв. до н. э. об этом писали исследователи Теофраст, Катон, Варрон, Плиний и Вергилий. Первое научное объяснение способности бобовых растений накапливать азот принадлежит агрохимику Дж. Буссенго (1838). Он установил, что люцерна и клевер обогащают почву азотом, зерновые же и корнеплоды истощают. Эти факты он связал со способностью бобовых растений фиксировать азот из воздуха. Однако Буссенго считал, что агентом фиксации являются листья бобового растения. Именно это неправильное заключение через 15 лет привело Буссенго к отрицанию своего открытия.

Стремясь более веско доказать правоту своей мысли, Буссенго провел серию опытов. В отличие от проводимых им ранее экспериментов он на прокаленном песке выращивал теперь уже не проростки бобовых растений, пересаженных с поля, а тщательно промытые семена (люпин и бобы); сосуды с растениями помещались при этом под стеклянный колпак. В таких условиях обогащения растений «воздушным азотом» не произошло. Сейчас это понятно и легко объяснимо. Именно тщательность постановки опыта, которая исключала возможность заражения корневой системы проростков клубеньковыми бактериями, привела Буссенго к результатам, опровергшим прежние его данные. Считая, тем не менее, последние опыты более достоверными и не предполагая даже о существовании клубеньковых бактерий, он признал результаты прежних опытов ошибочными и отрекся от них.

Понадобилось еще несколько десятилетий, прежде чем удалось установить, что молекулярный азот бобовые растения фиксируют только в симбиозе с микроорганизмами, вызывающими образование клубеньков на их корнях. Огромный опыт, накопившийся к настоящему времени, свидетельствует о большой роли бобовых растений в плодородии почв. Прянишников указывает, что после введения в Европе севооборотов с посевом клевера средняя урожайность зерновых повысилась с 7 до 17 ц на 1 га. В Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева урожаи ржи в шестипольном севообороте с клевером однолетнего пользования на протяжении 50 лет без внесения минеральных удобрений сохраняются на уровне 14 га на 1 га, а без клевера урожай достигает лишь 7 ц. На более плодородных почвах при хорошей агротехнической обработке бобовые растения повышают урожайность еще больше.

Поэтому не удивительно, что в странах с высокоразвитым земледелием обычно до 20- 25% окультуренной площади занято бобовыми растениями. При этом одновременно можно получить и ценный корм — зеленую массу растений, и обогащение почвы азотом. Бобовые растения играют, по-видимому, главную роль в связывании молекулярного азота в возделываемых почвах. Однако не все виды бобовых растений в равной степени обогащают почву. Общее увеличение количества азота в надземной массе и пожнивных остатках при культивировании люпина составляет 150-200 кг, клевера красного — 180 кг, люцерны — 300 кг, донника — 150 кг, зерновых бобовых — 50 — 60 кг азота в год на 1 га почвы. При этом прибыль азота в почве для всех перечисленных видов, за исключением зерновых бобовых, составляет примерно 50-70 кг на 1 га.

В настоящее время известно также свыше 200 различных видов других растений, для которых способность фиксировать азот в симбиозе с микроорганизмами, образующими клубеньки на корневой системе или на их листьях, вполне доказана. Большинство из них относится к деревьям и кустарникам.

Около 80 лет назад С. Н. Виноградский выделил из почвы анаэробную бактерию Clostridium pasteurianum, фиксирующую газообразный азот. Несколько позднее М. Бейеринк открыл аэробную азотфиксирующую бактерию Azotobacter. В дальнейшем список азотфиксаторов пополнился новыми видами микроорганизмов — представителей других систематических групп. Деятельность всех свободноживущих азотфиксирующих бактерий в почве ограничена недостатком органических веществ. Поэтому они и не могут обеспечить значительного накопления азота (в среднем они накапливают не более 5 кг азота на 1 га). Их деятельность можно активировать внесением свежего органического вещества. Прянишников считал, что дефицит азота в 13-14 кг на 1 га компенсируется деятельностью свободноживущих азотфиксаторов и поступлением соединений азота с дождевыми водами.

 Клубеньковые бактерии бобовых

Данные палеонтологии свидетельствуют о том, что самыми древними бобовыми культурами, имевшими клубеньки, были некоторые растения, принадлежащие к группе Eucaesalpinioideae. У современных видов бобовых растений клубеньки обнаружены на корнях многих представителей семейства Рарilijоnасеае. Филогенетически более примитивные представители таких семейств, как Caesalpiniaceae Mimosaceae, в большинстве случаев клубеньков не образуют.

Из 13 тысячи видов входящих в 550 родов бобовых растений, наличие клубеньков выявлено пока только приблизительно у 1300 видов (243 рода) на рисунке 23 показаны некоторые представители азотфиксаторов. Сюда в первую очередь относятся виды растений, использующиеся в сельском хозяйстве. После формирования клубеньков, бобовые растения приобретают способность усваивать атмосферный азот. Однако они способны поглощать и связанные формы азота — соли аммония и азотной кислоты. Лишь одно растение — копеечник (Hedysarum coronarium) — ассимилирует только молекулярный азот. Поэтому без клубеньков в природе это растение не встречается. Клубеньковые бактерии снабжают бобовое растение азотом, который фиксируют из воздуха. Растения же, в свою очередь, поставляют бактериям продукты углеводного обмена и минеральные соли, необходимые им для роста и развития.

clip_image004

1 – из клубеньков кормовых бобов (увеличение х 300); 2 – из люцерны (х 7000); 3 – из клевера (х 10000).

Рисунок 23 — Клетки клубеньковых бактерий (по В. Шильниковой, 1974)

В 1866 г. известный ботаник и почвовед М. С. Воронин увидел в клубеньках на корнях бобовых растений мельчайшие «тельца». Он предположил, что образование клубеньков связано с деятельностью бактерий, а усиленное деление клеток ткани корня с реакцией растения на проникшие в корень бактерии. 20 лет спустя М. Бейеринк выделил из клубеньков гороха, вики, чины, фасоли, сераделлы и лядвенца бактерии и изучал их свойства, проверив способность заражать растения и вызывать образование клубеньков. Он назвал эти микроорганизмы Bacillus radicicola. Поскольку к роду Bacillus относятся бактерии, образующие споры, а клубеньковые бактерии лишены этой способности, А. Пражмовский переименовал их в Bacterium radicicola. Б. Франк предложил более удачное родовое название клубеньковых бактерий — Rhizobium (от греч. rhizo — корень, bio — жизнь; жизнь на корнях). Это название привилось и используется в литературе до сих пор.

Для обозначения вида клубеньковых бактерий принято к родовому названию Rhizobium добавлять термин, соответствующий латинскому названию того вида растения, из клубеньков которого они выделены и на котором могут образовывать клубеньки. Например, Rhizobium trifolii — клубеньковые бактерии клевера, Rhizobium lupini — клубеньковые бактерии люпина и т. д. В тех случаях, если клубеньковые бактерии способны образовывать клубеньки на корнях разных видов бобовых растений, т. е. вызывать так называемое перекрестное заражение, видовое название является как бы собирательным — в нем отражена именно эта «перекрестно заражающая» способность. Например, Rhizobium leguminosarum — клубеньковые бактерии гороха (Pisum), чечевицы (Lens), чины (Lathyrus).

 Морфология и физиология клубеньковых бактерий

Для клубеньковых бактерий характерна полиморфность — разнообразие форм. На это обращали внимание многие исследователи, изучая, клубеньковые бактерии в чистой культуре в лабораторных условиях и почве. Они могут быть палочковидными и овальными, среди них встречаются фильтрующиеся формы, L-формы, кокковидные — неподвижные и подвижные организмы.

Молодые клубеньковые бактерии в чистой культуре на питательных средах обычно имеют палочковидную форму, размер палочек примерно 0,5-0,9 на 1,2-3,0 мкм, подвижные, размножаются делением. У палочковидных клеток клубеньковых бактерий клевера деление происходит перешнуровыванием. С возрастом палочковидные клетки могут переходить к почкованию. По Граму клетки окрашиваются отрицательно, ультратонкая структура их типична для грамотрицательных бактерий. При старении клубеньковые бактерии теряют подвижность и переходят в состояние так называемых опоясанных палочек. Такое название они получили вследствие чередования в клетках плотных и неплотных участков протоплазмы. Вероятно, с возрастом бактериальная клетка наполняется жировыми включениями, не воспринимающими окраску и вследствие этого обусловливающими исчерченность клетки. Стадия «опоясанных палочек» предшествует стадии формирования бактероидов — клеток неправильной формы: утолщенных, разветвленных, сферических, грушевидных и колбовидных — рисунок 24. Термин «бактероиды» ввел в литературу Дж. Брунхорст в 1885 г., применив его к необычным по форме образованиям, значительно более крупным, чем палочковидные клетки бактерий, встречающимся в тканях клубеньков.

clip_image006


Рисунок 24 — Бактероиды клубеньковых бактерий клевера. Слева видна клетка со жгутиком. Увел. х16 000. (по В. Шильниковой, 1974)

Бактероиды характеризуются более высоким содержанием гликогена и жира, чем палочковидные клетки. Бактероиды, выращенные в искусственных питательных средах и образовавшиеся в тканях клубенька, физиологически однотипны. Есть мнение, что бактероиды — это формы бактерий с незавершенным процессом деления. При незавершенном делении клеток клубеньковых бактерий возникают дихотомически ветвящиеся формы бактероидов. Количество бактероидов увеличивается при старении культуры; их появлению способствуют истощение питательной среды, накопление продуктов обмена, внесение в среду алкалоидов.

На питательных средах клубеньковые бактерии различных видов бобовых растений растут с разной скоростью. К быстрорастущим относятся клубеньковые бактерии гороха, клевера, люцерны, кормовых бобов, вики, чечевицы, чины, донника, пажитника, фасоли, нута, лядвенца; к медленнорастущим — клубеньковые бактерии люпина, сои, арахиса, сераделлы, маша, вигны, эспарцета, дрока. Вполне сформировавшиеся колонии быстрорастущих культур можно получить на 3 — 4-е сутки инкубации, колонии медленнорастущих — на 7 — 8-е.

У клеток клубеньковых бактерий при выращивании на жидких средах образуются жгутики, нитевидные и четковидные выросты, длина которых достигает 8 — 10 мкм. Колонии быстрорастущих клубеньковых бактерий имеют цвет топленого молока, часто полупрозрачные, слизистые, с ровными краями, умеренно выпуклые, со временем разрастаются на поверхности агаризованной среды. Колонии медленнорастущих бактерий более выпуклые, мелкие, сухие, плотные и, как правило, не разрастающиеся на поверхности среды. Слизь, вырабатываемая клубеньковыми бактериями, представляет собой комплексное соединение полисахаридного типа, в состав которого входят гексозы, пентозы и уроновые кислоты.

Клубеньковые бактерии – микроаэрофилы, то есть развиваются даже при незначительных количествах кислорода в среде, но предпочитают, аэробные условия. В качестве источника углерода в питательных средах клубеньковые бактерии используют углеводы и органические кислоты, в качестве источника азота — разнообразные минеральные и органические азотсодержащие соединения. При культивировании на средах с высоким содержанием азотсодержащих веществ клубеньковые бактерии могут утратить способность проникать в растение и образовывать клубеньки, поэтому обычно клубеньковые бактерии выращивают на растительных экстрактах (фасолевом, гороховом отваре) или почвенных вытяжках. Необходимый для развития фосфор клубеньковые бактерии могут получать из минеральных и органических фосфорсодержащих соединений; источником кальция, калия и других минеральных элементов могут служить минеральные соединения.

Для подавления посторонней сапрофитной микрофлоры при выделении клубеньковых бактерий из клубеньков или непосредственно из почвы рекомендуются питательные среды с добавлением кристаллического фиолетового, танина или антибиотиков. Для развития большинства культур клубеньковых бактерий требуется оптимальная температура в пределах 24-26°. При 0° и 37°С рост приостанавливается. Обычно культуры клубеньковых бактерий в условиях лаборатории хранят при пониженных температурах (2-4 °С).

Многие виды клубеньковых бактерий способны синтезировать витамины группы В, а также ростовые вещества типа гетероауксина (бета-индолилуксусная кислота). Все клубеньковые бактерии приблизительно одинаково устойчивы к щелочной реакции среды (рН = 8,0), но неодинаково чувствительны к кислой.

 Специфичность и активность клубеньковых бактерий

Специфичность клубеньковых бактерий может быть узкой (клубеньковые бактерии клевера заражают только группу клеверов — видовая специфичность, а клубеньковые бактерии люпина могут характеризоваться даже сортовой специфичностью — заражать только алкалоидные или безалкалоидные сорта люпина). При широкой специфичности клубеньковые бактерии гороха могут заражать растения гороха, чины, бобов, а клубеньковые бактерии чины и бобов могут заражать растения гороха, т. е. все они характеризуются способностью «перекрестного заражения».

Специфичность клубеньковых бактерий лежит в основе их классификации. Её возникновение связано с длительным приспособлением к одному растению или к группе их и генетической передачи этого свойства. В связи с этим различная приспособленность клубеньковых бактерий к растениям имеется и в пределах группы перекрестного заражения. Так, клубеньковые бактерии люцерны могут образовать клубеньки у донника. Но, тем не менее, они более приспособлены к люцерне, а бактерии донника — к доннику.

В процессе инфекции корневой системы бобовых растений клубеньковыми бактериями большое значение имеет вирулентность микроорганизмов. Если специфичностью определяется спектр действия бактерий, то вирулентность клубеньковых бактерий характеризует активность их действия в пределах данного спектра. Под вирулентностью подразумевается способность клубеньковых бактерий проникать в ткань корня, размножаться там и вызывать образование клубеньков. Большую роль играет не только сама способность проникать в корни растения, но и скорость этого проникновения.

Для определения вирулентности штамма клубеньковых бактерий установливают его способность вызывать образование клубеньков. Критерием вирулентности любого штамма может служить то минимальное количество бактерий, которое обеспечивает более энергичное инфицирование корней по сравнению с другими штаммами, завершающееся формированием клубеньков.

На рисунке 25 показано влияние разных по активности культур клубеньковых бактерий на развитие клевера, справа изображено растение, зараженное неактивной культурой. Эффективное снабжение растения азотом, способствует ускоренному, по сравнению с контролем росту и развития растения клевера.

clip_image008

Справа — растение, зараженное неактивной культурой.

Рисунок 25 — Влияние разных по активности культур клубеньковых бактерий на развитие клевера. (по В. Шильниковой, 1974)

Инфицирование бобового растения клубеньковыми бактериями

Для обеспечения нормального процесса инфицирования корневой системы клубеньковыми бактериями нужно наличие довольно большого количества жизнеспособных клеток бактерий в прикорневой зоне. Мнения исследователей в отношении количества клеток, необходимых для обеспечения процесса инокуляции, различны. Так, по данным О. Аллена, для инокуляции мелкосеменных растений требуется 500-1000 клеток, для инокуляции крупносеменных — не менее 70 000 клеток на 1 семя. По мнению Дж. Винцента, в момент инокуляции на каждое семя должно приходиться по крайней мере несколько сотен жизнеспособных и активных клеток клубеньковых бактерий. Имеются данные, что в ткань корня могут внедряться и единичные клетки.

При развитии корневой системы бобового растения размножение клубеньковых бактерий на поверхности корня стимулируется выделениями корня. Продукты разрушения корневых чехликов и волосков играют также немаловажную роль в обеспечении клубеньковых бактерий подходящим субстратом. В ризосфере бобового растения резко стимулируется развитие клубеньковых бактерий, для злаковых растений такого явления не наблюдается.

На поверхности корня имеется слой слизистого вещества (матрица), образующийся независимо от наличия в ризосфере бактерий. Клубеньковые бактерии после инокуляции обычно устремляются к этому слою и скапливаются в нем благодаря стимулирующему действию корня, которое проявляется на расстоянии до 30 мм. В этот период, предшествующий внедрению клубеньковых бактерий в ткань корня, бактерии в ризосфере очень подвижны.

О механизме проникновения клубеньковых бактерий в корень растения существует ряд гипотез. Авторы одной из них утверждают, что клубеньковые бактерии проникают в корень через повреждения эпидермальной и коровой ткани (особенно в местах ответвления боковых корней). Эта гипотеза была выдвинута на основании исследований Бриля еще в 1888 году, вызвавшего образование клубеньков у бобовых растений путем прокалывания корней иглой, погруженной предварительно в суспензию клубеньковых бактерий. Некоторое подтверждение этому находят у арахиса, у которого клубеньки располагаются преимущественно в пазухах ответвлений корней, что наводит на мысль о проникновении клубеньковых бактерий в корень через разрывы при прорастании боковых корней.

Другая гипотеза обосновывает проникновение клубеньковых бактерий в ткань корня через корневые волоски рисунок 26. Путь прохождения клубеньковых бактерий через корневые волоски признает большинство исследователей.

Кажется убедительным предположение П. Дарта и Ф. Мерсера (1965) о том, что клубеньковые бактерии внедряются в корень в виде мелких (0,1-0,4 мкм) кокковидных клеток через промежутки (0,3-0,4 мкм) целлюлозной фибриллярной сети первичной оболочки корневых волосков. Электронно-микроскопические фотографии – рисунок 27 — поверхности корня, полученные методом реплик, и факт мельчания клеток клубеньковых бактерий в ризосфере бобовых растений подтверждают это положение.

clip_image010

Стрелкой показано движение клеток клубеньковых бактерий к вершине корневого волоска клевера.

Рисунок 26 — Скопления клубеньковых бактерий вокруг корневых волосков (по В. Шильниковой, 1974)

Рисунок 27 — Клетки клубеньковых бактерий на поверхности инфицированного корневого волоска бобового растения (по П. Дарту, Ф. Мерсеру).

Не исключено, что клубеньковые бактерии могут проникать в корень через эпидермальные клетки молодых верхушек корня. По мнению Пражмовского (1889), бактерии могут проникать в корень только через молодую клеточную оболочку (корневых волосков или эпидермальных клеток) и совершенно не способны преодолевать химически измененный или опробковевший слой коры. Этим можно объяснить, что клубеньки обычно развиваются на молодых участках главного корня и появляющихся боковых корнях.

В последнее время большую популярность получила ауксинная гипотеза. Авторы этой гипотезы считают, что клубеньковые бактерии проникают в корень благодаря стимуляции синтеза гетероауксина из триптофана, имеющегося всегда в корневых выделениях растений. С наличием гетероауксина связывается искривление корневых волосков, которое обычно наблюдается при инфицировании корневой системы клубеньковыми бактериями.

Источником бета-индолилуксусной кислоты в момент инфицирования растения, очевидно, служат не только растения, выделяющие через корневую систему триптофан, который многие виды бактерий, в том числе и клубеньковые, могут переводить в бета-индолилуксусную кислоту. Сами клубеньковые бактерии, а возможно, и другие виды почвенных микроорганизмов, живущие в зоне корня, также могут участвовать в синтезе гетероауксина. Однако действие гетероауксина неспецифично и вызывает искривление корневых волосков у разных видов растений, а не только бобовых. В то же время клубеньковые бактерии вызывают искривление корневых волосков лишь у бобовых растений, проявляя при этом довольно значительную избирательность. Если бы рассматриваемый эффект определялся только (З-индолилуксусной кислотой), то такой специфики не было бы. Кроме того, характер изменений корневых волосков под влиянием клубеньковых бактерий несколько иной, чем под влиянием гетероауксина.

Также отмечают, что в отдельных случаях инфицированию подвергаются не искривленные корневые волоски. Наблюдения показывают, что у люцерны и гороха искривляются и закручиваются 60-70% корневых волосков, а у клевера — около 50%. У некоторых видов клевера эта реакция отмечается не более чем у четверти заражаемых волосков. В реакции искривления, очевидно, имеет большое значение состояние корневого волоска. Растущие корневые волоски наиболее чувствительны к действию веществ, вырабатываемых бактериями.

Известно, что клубеньковые бактерии вызывают размягчение стенок корневых волосков. Однако ни целлюлазы, ни пектинолитических ферментов они не образуют. В связи с этим было высказано предположение, что клубеньковые бактерии проникают в корень благодаря выделению ими слизи полисахаридной природы, вызывающей синтез растениями фермента полигалактуроназы. Этот фермент, разрушая пектиновые вещества, влияет на оболочку корневых волосков, делая ее более пластичной и проницаемой. В небольших количествах полигалактуроназа всегда присутствует в корневых волосках и, очевидно, вызывая частичное растворение соответствующих компонентов оболочки, позволяет клетке растягиваться.

Некоторые исследователи полагают, что клубеньковые бактерии проникают в корень благодаря бактериям-спутникам, продуцирующим пектинолитические ферменты. Эта гипотеза была выдвинута на основании следующих фактов. При микроскопировании корневых волосков многие исследователи отмечали наличие светлого пятна, около которого скапливаются клубеньковые бактерии. Это пятно, возможно, является признаком начала мацерации (разрушения) ткани протопектиназой по аналогии с таким же признаком, наблюдающимся у растений при многих бактериальных заболеваниях. Кроме того, установлено, что авирулентные культуры клубеньковых бактерий в присутствии бактерий, продуцирующих пектинолитические ферменты, становятся способными проникать в корень.

Следует отметить еще одну гипотезу, по которой клубеньковые бактерии попадают в корень при образовании пальцевидного впячивания поверхности корневого волоска. Гипотеза инвагинации, по существу, не может быть отделена от ауксинной или ферментативной гипотезы, поскольку инвагинация происходит в результате воздействия либо ауксинного, либо ферментного фактора.

Процесс внедрения клубеньковых бактерий в ткань корня одинаков у всех видов бобовых растений и состоит из двух фаз. В первую фазу происходит инфицирование корневых волосков. Во вторую фазу интенсивно идет процесс образования клубеньков. Продолжительность фаз различна у разных видов растений: у Trifolium fragiferum первая фаза продолжается 6 дней, у Trifolium nigrescens — 3 дня. В некоторых случаях очень трудно обнаружить границы между фазами. Наиболее интенсивное внедрение клубеньковых бактерий в корневые волоски происходит на ранних этапах развития растения. Вторая фаза заканчивается в период массового образования клубеньков. Нередко внедрение клубеньковых бактерий в корневые волоски продолжается уже и после того, как клубеньки сформировались на корнях. Эта так называемая избыточная или дополнительная инфекция происходит потому, что инфицирование волосков не прекращается длительное время. Тип развития, структура и плотность корневых волосков не влияют на скорость внедрения клубеньковых бактерий. Места образования клубеньков не всегда связаны с местами расположения инфицированных волосков. Проникнув в корень (через корневой волосок, эпидермальную клетку, места повреждений корня),

клубеньковые бактерии далее перемещаются в ткани корня растения. Наиболее легко бактерии проходят через межклеточные пространства.

Внедриться в ткань корня может или одиночная клетка, или группа клеток бактерий. Если внедрилась отдельная клетка, она и в дальнейшем может перемещаться по ткани как одиночка. Путь инфицирования корня одиночными клетками свойствен растениям люпина. Однако в большинстве случаев внедрившаяся клетка, активно размножаясь, образует так называемые инфекционные нити и уже в виде таких нитей перемещается в ткани растения.

Термин «инфекционная нить» возник на основе изучения процесса инфицирования в световом микроскопе. Начиная с работ М. Бейеринка, инфекционная нить стала рассматриваться как слизистая гифообразная масса с заключенными в нее размножающимися бактериями. По существу, инфекционная нить — это колония размножившихся бактерий. Началом ее служит то место, куда проникла отдельная клетка или группа клеток. Не исключено, что колония бактерий, а следовательно, и будущая инфекционная нить, начинает формироваться еще на поверхности корня до момента внедрения бактерий в корень.

Количество инфицированных корневых волосков значительно различается у отдельных растений. Обычно инфекционные нити появляются в деформированных, искривленных корневых волосках. Однако есть указания, что и в прямых волосках иногда обнаруживаются подобные нити. Чаще в корневых волосках наблюдается одна разветвляющаяся нить, реже две. В некоторых случаях в одном корневом волоске имеется несколько нитей или же в нескольких имеются общие нити заражения, дающие начало одному клубеньку

Процент инфицированных корневых волосков в общем количестве деформированных очень низок. Он обычно колеблется от 0,6 до 3,2, изредка достигая 8,0. Доля удачных инфекций еще ниже, поскольку среди инфекционных нитей имеется много, до 80%, так называемых абортивных нитей, прекративших свое развитие. Скорость продвижения нормально развивающихся инфекционных нитей в растении составляет 5-8 мкм в час. При такой скорости путь через корневой волосок длиной 100-200 мкм инфекционная нить может пройти в течение одних суток.

 

Этапы развития симбиоза ризобий с бобовыми

Развитие симбиоза можно разделить на три основных этапа — преинфекция, инфекция и развитие клубенька, функционирование клубенька:

1). преинфекция. Происходит взаимное узнавание партнеров и подготовка к формированию симбиотической системы. Растение в нано- или пикомолярных концентрациях начинает продуцировать специфичные флавиноиды, которые активируют гены вирулентности (Nod-гены) ризобий. Nod-гены кодируют синтез Nod-факторов (липоолигосахаридов), вызывающих у растения-хозяина скручивание корневых волосков и образование клубеньковой меристемы.

2) инфекция и развитие клубеньков. В месте резкого сгиба волоска пектолитические ферменты растения разрушают клеточную стенку, через которую бактерии и проникают внутрь. Вокруг этих бактерий образуется полость – инфекционная нить, стенки ее образованы растительными клетками, а внутреннее пространство заполнено полисахаридами растения и микросимбионта.

3) далее происходит эндоцитоз ризобий из инфекционной нити внутрь клеток растения-хозяина. В цитоплазме растительной клетки бактерии окружаются специальными перибактероидными мембранами (ПБМ), синтезируемыми в основном растительной клеткой и частично ризобиями. Количество ризобиальных клеток внутри ПБМ зависит от вида растений: 5-10 – у вигны, фасоли и сои, по одной – у гороха, люцерны и клевера. Бактериальные клетки, окруженные общей ПБМ, называются симбиосомой и являются основной структурно-функциональной единицей симбиоза.

Большинство бобовых образуют внутриклеточный симбиоз с ризобиями, идущий по механизму «двойного эндоцитоза». Вскоре ризобии в ПБМ преобразуются в особые симбиотические формы – бактероиды, имеющие в три-пять раз большие размеры, чем свободноживущие бактерии. Все это способствует формированию на поверхности корней клубеньков. Морфология и число клубенька строго определяется растением-хозяином, что возможно связано с большой энергоемкостью их образования.

На поздних стадиях симбиоза проявляются такие важные для селекции растений признаки, как азотфиксирующая активность (скорость восстановления N2 в NH4+) и симбиотическая эффективность (способность растений интенсивно развиваться, используя симбиотрофное питание азотом). Хотя симбиотическая эффективность в основном определяется азотфиксирующей активностью клубеньков, но также зависит от совместимости метаболических систем партнеров и отсутствия активных защитных реакций растений на проникновение ризобий .

Систематика ризобий

Ризобии представляют собой грамотрицательные бактерии, образующие клубеньки с растениями семейства бобовых. Их систематика долгое время базировалась на хозяйской специфичности, проявляемой по отношению к разным видам бобовых растений. Но применение современных методов таксономии (геносистематика, нумерический анализ) показало, что систематика ризобий, основанная на филогенетическом родстве между разными их группами, не всегда совпадает с традиционной. Клубеньковые бактерии в настоящее время делят на пять родов: Azorhizobium, Rhizobium Mesorhizobium, Sinorhizobium (быстрорастущие) и Bradyrhizobium (медленнорастущие). Данные роды принадлежат к a-подгруппе протеобактерий, но их различия по культурально-биохимическим признакам и составу ДНК говорят о полифилетическом происхождении ризобий, т.е. их дивергенция от «общего предка» произошла задолго до появления бобовых растений. Так как последние образовались в позднем меловом или раннем третичном периоде, то, по-видимому, бобовые растения-хозяева и сыграли основную роль в возникновении бобово-ризобиалього симбиоза.

 Морфолого-анатомическая характеристика клубеньков в их онтогенезе

По способу образования клубеньки бобовых растений подразделяются на два типа:

— клубеньки возникают при делении клеток перицикла (корнеродного слоя), обычно расположенных против протоксилемы (первых по времени образования сосудов) — эндогенный тип образования клубеньков;

— клубеньки происходят из коры корня в результате внедрения возбудителя в паренхимные клетки коры и эндодермы (внутреннего слоя первичной коры) — экзогенный тип образования клубеньков.

В природе преобладает последний тип. Ткани центрального цилиндра корня принимают участие только в образовании сосудистой системы клубеньков как эндогенного, так и экзогенного типа. Несмотря на различные взгляды на природу возникновения клубеньков экзо- и эндотипов, процесс развития их в основном одинаков. Однако ни тот, ни другой тип образования клубеньков ни в коем случае не следует отождествлять с процессом образования боковых корней, несмотря на то, что существуют и отдельные черты сходства в их заложении. Так, формирование клубеньков и боковых корней происходит одновременно и к тому же в одной и той же зоне корня.

В то же время ряд особенностей развития боковых корней и клубеньков подчеркивает глубокие различия в типе их формирования. Боковые корни возникают в перицикле. С первых же моментов развития они связаны с центральным цилиндром главного корня, от которого ответвляются центральные цилиндры боковых корней, и возникают они всегда против луча первичной древесины. Формирование клубенька, в отличие от бокового корня, возможно в любом месте. В самом начале формирования клубеньковой ткани сосудистой связи с центральным цилиндром корня нет, она возникает позднее. Сосуды обычно формируются по периферии клубенька. Они связаны с сосудами корня через зону трахеид и имеют собственную эндодерму.

Различие в характере возникновения клубеньков и боковых корней особенно четко наблюдается у сераделлы, поскольку коровая ткань главного корня этого растения — место возникновения первых клубеньков — состоит из относительно небольшого слоя клеток и клубеньки становятся видимыми очень быстро после инфицирования корня бактериями. Они образуют сначала выступы уплощенной формы на корне, что позволяет отличить их от конических выступов боковых корней. Клубеньки отличаются от боковых корней и рядом анатомических признаков: отсутствием центрального цилиндра, корневых чехликов и эпидермиса, наличием значительного слоя коры, покрывающей клубенек.

Формирование клубеньков бобовых растений происходит в период, когда корень имеет еще первичную структуру. Оно начинается с деления коровых клеток, расположенных на расстоянии 2-3 слоев от концов инфекционных нитей. Слои коры, пронизанные инфекционными нитями, остаются без изменения. В то же время у сераделлы деление коровых клеток возникает непосредственно под инфицированным корневым волоском, а у гороха деление клеток отмечается только в предпоследнем слое коры.

Деление с образованием радиальной структуры ткани продолжается до внутренних коровых клеток. Происходит оно без определенного направления, беспорядочно, и в результате этого возникает меристема (система образовательных тканей) клубенька, состоящая из мелких зернистых клеток. Разделившиеся клетки коры изменяются: ядра округляются и увеличиваются в размерах, особенно увеличиваются ядрышки. После митоза ядра расходятся и, не принимая первоначальной формы, вновь начинают делиться, вследствие чего возникает вторичная меристема.

Вскоре в эндодерме и перицикле появляются признаки начинающегося деления, которое в прежних внешних клетках происходит главным образом тангентальными перегородками. Это деление распространяется, наконец, на общий меристематический комплекс, мелкие клетки которого вытягиваются, вакуоли исчезают, ядро заполняет большую часть клетки. Образуется так называемый первичный клубенек, в плазме клеток которого клубеньковые бактерии отсутствуют, поскольку они на данной стадии еще находятся внутри инфекционных нитей. В то время как образуется первичный клубенек, инфекционные нити многократно разветвляются и могут проходить или между клетками — интерцеллюлярно, или сквозь клетки — интрацеллюлярно — и вносить бактерии.

Межклеточные инфекционные нити вследствие активного размножения в них клубеньковых бактерий нередко приобретают причудливую форму — формируются в виде карманов (дивертикулов) или факелов. Процесс передвижения инфекционных нитей из клетки в клетку не совсем ясен. По-видимому, инфекционные нити, как полагает микробиолог Д. Джордан, блуждают в виде голых слизистых тяжей в межклеточных промежутках растительной ткани до тех пор, пока вследствие каких-то еще необъяснимых причин не начинают инвагинировать в цитоплазму примыкающих клеток.

В некоторых случаях инвагинация инфекционной нити происходит в одну, в некоторых случаях — в каждую соседнюю клетку. По этим инвагинированным трубчатым полостям (дивертикулам) перетекает заключенное в слизь содержимое нити. Наиболее активный рост инфекционных нитей происходит обычно вблизи ядра растительной клетки. Проникновение нити сопровождается перемещением ядра, которое продвигается к месту инфекции, увеличивается, меняет форму и дегенерирует. Подобная картина наблюдается при грибной инфекции, когда ядро нередко устремляется навстречу внедрившимся гифам, притягивается к повреждению как к месту наибольшей физиологической активности, вплотную придвигается к нити, разбухает и разрушается. По-видимому, это характерно для ответной реакции растения на инфекцию.

У однолетних растений инфекционные нити возникают обычно в первый период инфицирования корня, у многолетних — в течение длительного периода развития.

Бактерии могут высвобождаться из инфекционной нити в разное время и разными способами. Выход бактерий, как правило, весьма длительный процесс, особенно у многолетних растений. Обычно выход бактерий из инфекционной нити в цитоплазму растения-хозяина связывают с внутренним давлением, возникающим вследствие интенсивного размножения бактерий в нити и экскреции ими слизи. Иногда бактерии выскальзывают из нити группами, окруженными слизью инфекционной нити. в виде везикул (пузыревидных образований). Поскольку везикулы не имеют оболочек, выход из них бактерий очень прост. В клетки растений клубеньковые бактерии могут попадать и поодиночке из межклеточных пространств

 

Наполняющиеся быстро размножающимися клетками клубеньковых бактерий растительные клетки начинают усиленно делиться. В момент митотического деления зараженных клеток клубеньковые бактерии могут скапливаться на двух противоположных полюсах материнской клетки и пассивно попадать в дочерние клетки. Каждая из незараженных клеток находится при этом под сильным стимулирующим воздействием клубеньковых бактерий и вследствие этого также делится. Благодаря такому энергично протекающему митотическому делению меристематических клеток осуществляется распространение клубеньковых бактерий в ткани клубенька и увеличение объема бактероидной области.

Инфицированная ткань, состоящая из плотно лежащих и активно делящихся клеток, имеет сначала форму усеченного конуса. В дальнейшем вследствие постепенного роста этого конуса и одновременного деления и развития меристематических клеток ткань клубенька разрастается, утрачивая конусовидность.

Таким образом, клубенек увеличивается сначала в результате радиального и тангентального деления коровых клеток, а затем за счет увеличения их размера и одновременного деления. После того как растительные клетки полностью заполнятся бактериями, митоз прекращается. Однако клетки продолжают увеличиваться в размере и часто сильно вытягиваются. Размер их в несколько раз больше, чем у неинфицированных растительных клеток, которые расположены между ними в бактероидной зоне клубенька.

Связь молодого клубенька с корнем бобового растения осуществляется благодаря сосудисто-волокнистым пучкам. Впервые сосудисто-волокнистые пучки наблюдал М. С. Воронин еще в 1866 году. Время возникновения сосудистой системы в клубеньках различных видов бобовых растений различно. Так, у клубеньков сои начало развития сосудистых пучков совпадает с моментом проникновения клубеньковых бактерий в два слоя коровой паренхимы. С ростом клубенька проводящая система разрастается, разветвляется и окружает бактероидную область.

Одновременно с процессом дифференциации сосудистой системы идет формирование клубеньковой эндодермы из внешнего слоя первичного клубенька. Затем клубенек округляется, его периферийный клеточный слой окружается клубеньковой корой. Корневой эпидермис разрывается, а клубенек продолжает развиваться и увеличиваться в размерах.

С помощью светового микроскопа на продольных срезах зрелых клубеньков обычно четко выделяются 4 характерные зоны тканевой дифференциации: кора, меристема, бактероидная зона и сосудистая система. Все ткани клубенька дифференцируются в акропетальной последовательности, так как новые клетки закладываются меристемой.

Клубеньковая кора — оболочка клубенька, выполняющая защитную функцию. Кора состоит из нескольких рядов незараженных паренхимных клеток, величина и особенности которых различны у разных бобовых культур. Чаще всего клетки коры имеют вытянутую форму и крупнее по сравнению с другими клетками клубенька. В коре клубеньков многолетних деревянистых видов часто встречаются клетки с опробковевшими оболочками, содержащие смолы, танин, дубильные вещества.

Клубеньковая меристема расположена под клетками коры и представляет собой зону интенсивно делящихся также незараженных клеток. Для меристемы клубенька характерны плотно расположенные, без межклетников, мелкие тонкостенные клетки неправильной формы. Клетки меристемы клубенька подобны клеткам других типов меристематической ткани (верхушки корня, верхушки стебля). Клетки клубеньковой меристемы содержат плотную, тонко гранулированную цитоплазму с рибосомами, телами Гольджи, протопластидами, митохондриями и другими структурами. Встречаются небольшие вакуоли. В центре цитоплазмы расположено крупное ядро с ядерной мембраной, порами и четко выраженным ядрышком. Функции меристематических клеток заключаются в формировании клеток клубеньковой коры, бактероидной области и сосудистой системы. В зависимости от расположения меристемы клубеньки имеют разнообразную форму: шаровидную (горох, фасоль, сераделла, арахис) или цилиндрическую (люцерна, вика, чина, акация, клевер) рисунок 31. Меристема, расположенная отдельными участками по периферии клубенька, приводит к образованию муфтообразных клубеньков у люпина.

Клубеньковая меристема функционирует долго, даже во время некроза клубеньков, когда они уже наполнены лизирующейся бактероидной массой и разрушенными растительными клетками.

Бактероидная зона клубенька занимает его центральную часть и составляет от 16 до 50% от общей сухой массы клубеньков. В первый период формирования клубенька она, по существу, является бактериальной зоной — рисунок 32, так как заполнена клетками бактерий, находящихся в бактериальной, а не бактероидной стадии развития. Тем не менее, принято, когда идет речь о зоне клубеньковой ткани, содержащей бактерии, называть ее бактероидной. На рисунке 32 показаны клетки клубеньковых бактерий находящиеся вокруг ядра растительной клетки клубеньков вики.

Бактероидная область клубенька состоит в основном из инфицированных клубеньковыми бактериями клеток и частично из смежных с ними неинфицированных клеток, заполненных пигментами, дубильными веществами, а к осени — крахмалом. В клубеньках, образованных эффективными штаммами клубеньковых бактерий, средний относительный объем бактероидной зоны выше, чем в клубеньках, сформировавшихся при внедрении неэффективных штаммов.

В некоторых случаях объем бактероидной области достигает максимума в ранний период жизни клубенька и впоследствии остается относительно постоянным. Бактероидная зона пронизана густой сетью инфекционных нитей, а по периферии окружена сосудисто-волокнистыми пучками. Форма бактероидов в клубеньках разных видов бобовых культур может быть разнообразной. Так, у вики, чины и гороха они двухветвистые или вильчатые. Для клевера и эспарцета преобладающая форма бактероидов шаровидная, грушеобразная, вздутая, яйцевидная, для нута округлая. Форма бактероидов фасоли, сераделлы, лядвенца и люпина практически палочковидная.

1, 2 — горох ; 3, 6 (справа) — люпин; 4 — арахис (по Е. Швингхамеру); 5 — чина, клевер, вика, 6 (слева) — люцерна (по Я. Дэйту); 7 — разные виды дикорастущих бобовых растений

Рисунок 31 — Форма клубеньков у бобовых растений: (по А.Р. Вернеру, Н.Я. Гордиенко)

Рисунок 32 — Клетки клубеньковых бактерий вокруг ядра растительной клетки клубеньков вики. Увеличение х 20 000. (по В. Шильниковой, 1974)

Бактероиды заполняют большую часть растительной клетки, за исключением центральной зоны ядра и вакуолей. Так, процент бактероидов в бактероидной зоне окрашенного в розовый цвет клубенька составляет 94,2 к общему числу клубеньковых бактерий. Клетки бактероидов в 3-5 раз больше клеток бактерий – рисунок 33.

clip_image012

1 — увеличение х25 000; 2 – увеличение х15 000.

Рисунок 33 — Переход бактерий в бактероиды и сформировавшаяся бактероидная ткань (справа) в клубеньках люцерны. (по В. Шильниковой, 1974)

Бактероиды клубеньковых бактерий представляют особый интерес в связи с тем, что они являются, чуть ли не единственными обитателями клубеньков бобовых растений в период интенсивного связывания ими атмосферного азота. Отдельные исследователи считают бактероиды патологическими дегенеративными формами и не связывают процесс азотфиксации с бактероидной формой клубеньковых бактерий. Большинство исследователей находят, что бактероиды являются самыми жизнеспособными и активными формами клубеньковых бактерий и фиксация азота атмосферы бобовыми растениями осуществляется только при их участии

Сосудистая система клубенька обеспечивает связь между бактериями и растением-хозяином. По сосудистым пучкам транспортируются питательные вещества и продукты обмена. Сосудистая система развивается рано и функционирует длительное время. Вполне сформировавшиеся сосуды имеют определенное строение: состоят из трахеид ксилемы, волокон флоэмы, ситовидных трубок и сопровождающих клеток.

В зависимости от вида бобовых культур связь клубенька осуществляется посредством одного или нескольких сосудистых пучков. Например, у гороха в основании клубенька имеется два дифференцированных сосудистых узла. Каждый из них обычно дважды дихотомически разветвляется, и в результате сквозь клубенек от места второго дихотомического разветвления проходит 8 пучков. Многие растения имеют лишь один пучок, в то же время у одного клубенька Sesbania grandiflora в возрасте одного года их удалось насчитать до 126. Довольно часто сосудистая система клубенька отделяется с внешней стороны от его коры слоем частично или полностью опробковевших клеток, получивших название клубеньковой эндодермы, соединенных с эндодермой корня. Клубеньковая эндодерма представляет собой внешний слой неинфицированной коровой паренхимы, расположенной между клубеньковой тканью и корневой корой.

У большей части видов растений клубеньки образуются по описанному типу. Следовательно, образование клубеньков — результат сложных явлений, начинающихся вне корня. Вслед за начальными фазами инфекции индуцируется образование клубенька, затем происходит распространение бактерий в зоне клубеньковой ткани и фиксация азота.

Все стадии развития клубеньковых бактерий, по данным микробиолога В. Каша, можно проследить на срезах клубеньков. Так, в верхней части клубенька, например, люцерны содержатся в основном мелкие делящиеся палочковидные клетки, в небольшом количестве молодые бактероиды, число которых возрастает постепенно по мере развития клубенька. В средней, окрашенной в розовый цвет части клубенька обнаруживаются преимущественно бактероидные клетки и реже мелкие палочковидные. В основании клубенька на ранних стадиях вегетации растения-хозяина бактероиды такие же, как и в средней его части, а к концу вегетации более раздутые и раньше дегенерирующие.

Сроки появления первых видимых клубеньков на корнях различных видов бобовых растений различны. Появление их у большинства бобовых культур чаще всего происходит во время развития первых настоящих листьев. Так, образование первых клубеньков люцерны посевной наблюдается между 4-м и 5-м днями после прорастания, а на 7 — 8-й день этот процесс происходит у всех растений. Клубеньки у люцерны серповидной появляются через 10 дней.

В период функционирования клубеньки обычно плотные. Клубеньки, образованные активными культурами бактерий, в молодом возрасте имеют беловатую окраску. К моменту проявления оптимальной активности они становятся розовыми. Клубеньки, возникшие при инфекции неактивными культурами бактерий, зеленоватого тона. Нередко их структура практически не отличается от структуры клубеньков, образованных при участии активных штаммов клубеньковых бактерий, но они преждевременно разрушаются. В некоторых случаях строение клубеньков, образуемых неактивными бактериями, отклоняется от нормы. Это выражается в дезорганизации клубеньковой ткани, утрачивающей обычно четко выраженную зональную дифференциацию.

Розовая окраска определяется наличием в клубеньках пигмента, по химическому составу близкого гемоглобину крови. В связи с этим пигмент называется леггемоглобином (легоглобином) — гемоглобином Leguminosae. Легоглобин содержится лишь в тех клетках клубеньков, в которых имеются бактероиды. Он локализован в пространстве между бактероидами и окружающей их мембраной. Количество его колеблется от 1 до 3 мг на 1 г клубенька, в зависимости от вида бобового растения.

У однолетних бобовых растений к концу вегетационного периода, когда заканчивается процесс азотфиксации, красный пигмент переходит в зеленый. Изменение цвета начинается у основания клубенька, позднее зеленеет его вершина. У многолетних бобовых растений позеленения клубеньков не происходит или оно наблюдается только у основания клубенька. У разных видов бобовых растений переход красного пигмента в зеленый происходит с разной степенью интенсивности и разной скоростью.

Клубеньки однолетних растений функционируют сравнительно недолго. У большинства бобовых культур некроз клубенька начинается в период цветения растения-хозяина и протекает обычно в направлении от центра к периферии клубенька. Один из первых признаков разрушения — образование слоя клеток с мощными стенками у основания клубенька. Этот слой клеток, расположенный перпендикулярно к главному сосуду корня, разъединяет его с клубеньком и задерживает обмен питательными веществами между растением-хозяином и тканями клубенька.

В клетках дегенерирующей ткани клубенька появляются многочисленные вакуоли, ядра теряют способность окрашиваться, часть клеток клубеньковых бактерий лизируется, часть мигрирует в окружающую среду в виде мелких кокковидных клеток-артроспор. Также пекращают функционировать в этот период и инфекционные нити. Клетки хозяина утрачивают тургор и сжимаются теми соседними клетками, которым он еще свойствен.

Старые клубеньки темные, дряблые, мягкие. При надрезе из них выступает водянистая слизь. Процессу разрушения клубенька, начинающегося с опробковения клеток сосудистой системы, способствуют понижение фотосинтетической активности растения, сухость или чрезмерная влажность среды. В разрушенном, ослизненном клубеньке обнаруживаются часто простейшие, грибы, бациллы и мелкие палочковидные клубеньковые бактерии. Состояние растения-хозяина оказывает влияние на длительность функционирования клубенька. Так, по данным Ф. Ф. Юхимчука, кастрируя или удаляя цветы люпина, можно продлить период его вегетации и вместе с тем время активной деятельности клубеньковых бактерий.

Клубеньки многолетних растений, в отличие от клубеньков однолетних, могут функционировать в течение многих лет. Так, например, карагана имеет многолетние клубеньки, в которых процесс старения клеток идет одновременно с образованием новых. У вистерии (глицинии китайской) также функционируют многолетние клубеньки, образуя на корнях хозяина шаровидные вздутия. К концу вегетационного периода бактероидная ткань многолетних клубеньков деградирует, но весь клубенек не отмирает. На следующий год он вновь начинает функционировать.

Организация клубеньков и биохимия азотфиксации

Микроорганизмы, усваивающие молекулярный азот, называются диазотрофами. Азотфиксирующий клубенек состоит из следующих частей:

а) инфицированная бактериями ткань;

б) проводящая ткань, поставляющая углеводы и выносящая продукты азотфиксации;

в) меристема, за счет которой идет рост клубенька.

Основным элементом симбиоза является нитрогеназа – многомерный фермент, состоящий из комплекса двух белков: MoFe-белка и Fe-белка. Нитрогеназы из разных азотфиксаторов несколько различаются своими молекулярными массами и содержанием металлов. Каждый из белков, в свою очередь, состоит из нескольких субъединиц. Молекулярная масса MoFe-белка различных нитрогеназ находится в пределах 200-250 кДа. Фермент содержит по два атома молибдена, 28-34 атома железа и 18-24 атома серы на одну молекулу. Молекулярная масса Fe-белка колеблется от 50 до 70 кДа и также содержит атомы железа и серы с молекулярной массой около 300 кДа. Нитрогеназа синтезируется в бактероидах и является катализатором фиксации азота:

Этот процесс требует значительных затрат энергии. По расчетам для клеток Rhizobium на восстановление одной молекулы N2необходимо до 25-35 молекул АТФ, то есть на каждый грамм фиксированного азота расходуется три-шесть грамм органического углерода. Другими словами, растение в клубеньки поставляет 30-40 % продуктов фотосинтеза. Примерно половина из них возвращается в надземную часть в виде азотистых соединений.

Нитрогеназа обладает низкой субстратной специфичностью, т.е. обладает способностью восстанавливать широкий спектр соединений с тройной связью, например, превращать ацетилен в этилен. Данная реакция применяется для определения нитрогеназной активности ацетиленовым методом. Для активной работы нитрогеназы необходимы микроаэрофильные условия, которые в клубеньке обеспечиваются диффузным барьером (слой плотно прилегающих друг к другу клеток во внутреннем кортексе) и синтезом леггемоглобина (гемоглобинподобный белок, синтезируемый растительными клетками).

Леггемоглобин связывает O2, транспортирует его к симбиосомам, обеспечивая дыхательную активность клубеньков. Он составляет 30 % белка в клубеньках и придает им ярко-розовый цвет. Леггемоглобин напоминает по своей структуре и функции гемоглобин человека и животных, специализирующийся, как известно, на транспорте О2 и СО2. Леггемоглобин находится в клетках клубеньков, где живут азотфиксирующие микроорганизмы. Нитрогеназный комплекс, образующий аммиак из воздуха, действует по физико-химическим законам очень экономно. Если в среде обитания достаточно ионов аммония или нитратов, он прекращает работу. Потребление растениями аммиака, образовавшегося при азотфиксации или восстановлении нитратов почвы, осуществляется ферментами, связанными с биосинтезом так называемых первичных аминокислот, прежде всего глютаминовой, аспарагиновой кислот и их амидов. В конечном итоге азот в виде аминогрупп вовлекается в серию биосинтетических реакций организма, поддерживая его жизненные функции.

 Диазотрофы

Если молекулярные механизмы фиксации азота различными диазотрофами очень схожи, то биология самих диазотрофов весьма различна. Во-первых, они могут являться бактериями, низшими грибами и водорослями, во-вторых, их рост, развитие, взаимоотношение с растениями и почвой имеют свои характерные отличительные черты. Так относящиеся к симбиотическим азотфиксаторам клубеньковые бактерии рода Rhizobium представляют собой микроорганизмы со средними размерами 0.7-1.8 мкм. Они подвижны в молодом возрасте, делятся перешнуровыванием и в дальнейшем теряют подвижность. Живут они в почве, на поверхности растений и способны при инфицировании бобовых вызывать образование клубеньков на корнях.

В основе способности инфицировать корневую систему хозяина лежит сложный и не вполне ясный молекулярный механизм, имеющий решающее значение в симбиотической фиксации азота. Обычно рассматриваются несколько его стадий:

— первая – приближение микробной клетки к растению за счет ее способности передвигаться в ответ на узнавание химических продуктов, выделяемых из корней растения. Этот процесс называется хемотаксисом;

— вторая стадия – контактное взаимодействие микроорганизма с растением. В этом процессе важное место отводится так называемому лектин-углеводному узнаванию растения микроорганизмом. Лектин корневых волосков растений – углеводузнающий белок. Он узнает углевод поверхности бактерий и прочно связывается с ним;

— третья стадия – механохимическая и весьма сложная по технике исполнения. Бактерии, внедрившиеся в молодой корневой волосок, в виде так называемых инфекционных нитей прорастают вдоль волоска, как бы перетекают в тетраплоидные клетки коры и вызывают их быстрое деление. Они заполняют своим содержимым внутренность растительных клеток. Так как заражение бывает множественным, ткани корня в зоне проникновения микроорганизмов растут интенсивнее с образованием клубеньков, клетки которых наполнены бактериями. Микробы при этом меняются и сами, они теряют клеточную стенку, изменяют свои размеры, геометрию. Кроме того, все они обволакиваются растительным белком – леггемоглобином. Размеры и число клубеньков на корнях бобовых в первом приближении указывает на эффективность азотфиксации. Азотфиксация и образование клубеньков подавляются при обильном и экологически вредном использовании химических азотных удобрений.

 Факторы, определяющие симбиотические взаимоотношения клубеньковых бактерий с бобовыми растениями

Для симбиоза азотфиксаторов с растениями, обеспечивающего хорошее развитие последних, необходим определенный комплекс условий среды. Если условия окружающей среды будут неблагоприятными, то, даже, несмотря на высокую вирулентность, конкурентную способность и активность микросимбионта, эффективность симбиоза будет низкой. Для развития клубеньков оптимальна влажность 60-70% от полной влагоемкости почвы. Минимальная влажность почвы, при которой еще возможно развитие клубеньковых бактерий в почве, приблизительно равна 16% от полной влагоемкости. При влажности ниже этого предела клубеньковые бактерии обычно уже не размножаются, но, тем не менее, они не погибают и могут длительное время сохраняться в неактивном состоянии. Недостаток влаги приводит и к отмиранию уже сформировавшихся клубеньков. Нередко в районах с недостаточным увлажнением многие бобовые растения развиваются, не образуя клубеньков.

Большое влияние на жизнедеятельность клубеньковых бактерий и образование клубеньков оказывает реакция почвы. Для разных видов и даже штаммов клубеньковых бактерий значение рН среды обитания несколько различно. Так, например, клубеньковые бактерии клевера более устойчивы к низким значениям р.Н, чем клубеньковые бактерии люцерны. Очевидно, здесь также сказывается адаптация микроорганизмов к среде обитания. Клевер растет на более кислых почвах, чем люцерна. Реакция почвы как экологический фактор оказывает влияние на активность и вирулентность клубеньковых бактерий. Наиболее активные штаммы, как правило, легче выделить из почв с нейтральными значениями рН. В кислых почвах чаще встречаются неактивные и слабовирулентные штаммы. Кислая среда (рН 4,0 — 4,5) оказывает непосредственное влияние и на растения, в частности нарушая синтетические процессы обмена веществ растений и нормальное развитие корневых волосков. В кислой среде у инокулированных растений резко сокращается срок функционирования бактероидной ткани, что ведет к снижению степени азотфиксации.

Размеры симбиотической азотфиксации определяются в значительной степени условиями питания растения-хозяина, а не клубеньковых бактерий. Клубеньковые бактерии как эндотрофные симбионты растений зависят в основном от растения при получении углеродсодержащих веществ и минеральных элементов питания.

Для клубеньковых бактерий ткань хозяина представляет такую питательную среду, которая может удовлетворить даже самый требовательный штамм вследствие содержания в ткани всех типов питательных веществ. Тем не менее, после внедрения клубеньковых бактерий в ткань растения-хозяина их развитие определяется не только внутренними процессами, но и в значительной степени зависит от действия внешних факторов, оказывающих влияние на весь ход инфекционного процесса. Содержание или отсутствие того или иного питательного вещества в окружающей среде может быть определяющим моментом для проявления симбиотической азотфиксации.

Обеспеченность бобовых растений доступными формами минеральных соединений азота определяет эффективность симбиоза. На основании многочисленных лабораторных и вегетационных опытов известно, что с увеличением азотсодержащих соединений в окружающей среде, внедрение бактерий в корень растений затрудняется.

Большое значение в активации усвоения азота бобовыми растениями имеет фосфорное питание. При низком содержании фосфора в среде проникновение бактерий в корень происходит, но клубеньки при этом не образуются. Бобовым растениям присущи некоторые особенности в обмене фосфорсодержащих соединений. Семена бобовых отличаются повышенным содержанием фосфора. Запасной фосфор при прорастании семян используется не так, как у других культур, — сравнительно равномерно для формирования всех органов, а в большей степени сосредоточиваясь в корнях. Поэтому в ранние сроки развития бобовые растения, в отличие от злаковых, в большей степени удовлетворяют свои потребности в фосфоре за счет семядолей, а не запасов почвы. Чем крупнее семена, тем меньше бобовые растения зависят от фосфора почвы. Однако при симбиотическом способе существования потребность бобовых растений в фосфоре выше, чем при росте и развитии растений в среде без азотфиксаторов. Поэтому при недостатке фосфора в среде у инокулированных растений ухудшается снабжение растений азотом.

Также бобовые растения выносят с урожаем значительно больше калия, чем другие сельскохозяйственные культуры. Поэтому калийные и особенно фосфорно-калийные удобрения существенно повышают продуктивность азотфиксации бобовыми растениями. Положительное действие калия на образование клубеньков и интенсивность азотфиксации связано в значительной степени с физиологической ролью калия в углеводном обмене растения.

Кальций нужен не только для устранения излишней кислотности почвы. Он играет специфическую роль в развитии клубеньковых бактерий и обеспечении нормального симбиоза бактерий с растением-хозяином. Потребность клубеньковых бактерий в кальции частично может быть компенсирована стронцием. Интересно, что клубеньковые бактерии тропических культур, растущих на кислых латеритных почвах, не нуждаются в кальции. В этом опять проявляется экологическая адаптация клубеньковых бактерий, поскольку тропические почвы содержат очень небольшие количества кальция.

Для симбиотической азотфиксации необходимы также магний, сера и железо. При недостатке магния тормозится размножение клубеньковых бактерий, снижается их жизнедеятельность, подавляется симбиотическая азот-фиксация. Сера и железо оказывают также благоприятное влияние на образование клубеньков и процесс азотфиксации, в частности играя несомненную роль в синтезе леггемоглобина.

Из микроэлементов особо отмечена роль молибдена и бора. При недостатке молибдена клубеньки плохо образуются, в них нарушается синтез свободных аминокислот и подавляется синтез леггемоглобина. Молибден вместе с другими элементами с переменной валентностью (Fe, Co, Си) служит посредником при переносе электронов в окислительно-восстановительных ферментных реакциях. При дефиците бора в клубеньках не формируются сосудистые пучки, и вследствие этого нарушается развитие бактероидной ткани.

На формирование клубеньков у бобовых растений большое влияние оказывает углеводный обмен растений, определяемый рядом факторов: фотосинтезом, наличием в среде углекислого газа, физиологическими особенностями растений. Улучшение углеводного питания благоприятно сказывается на инокуляционном процессе и азотонакоплении. С практической точки зрения большой интерес представляет использование соломы и соломистого свежего навоза для удобрения бобовых растений как источника углеводов. Но в первый год после внесения соломы в почву при ее разложении накапливаются токсические вещества. Следует отметить, что не все виды бобовых растений чувствительны к токсическим продуктам распада соломы; горох, например, не реагирует на них.

Определенное значение в симбиозе клубеньковых бактерий и бобовых растений имеют биологические факторы. Большое внимание уделяется влиянию ризосферной микрофлоры на клубеньковые бактерии, которое может иметь как стимуляционный, так и антагонистический характер в зависимости от состава микроорганизмов ризосферы.

Много работ посвящено изучению фагов клубеньковых бактерий. Большинство фагов способны лизировать различные виды бактерий, некоторые специализированы лишь в отношении отдельных видов или даже штаммов клубеньковых бактерий. Фаги могут препятствовать внедрению бактерий в корень, вызывать лизис клеток в ткани клубенька, они наносят большой ущерб, лизируя препараты клубеньковых бактерий на заводах, вырабатывающих нитрагин.

Среди различных видов насекомых, наносящих вред клубеньковым бактериям, особенно выделяется полосатый клубеньковый долгоносик, личинки которого разрушают клубеньки на корнях многих видов бобовых растений (главным образом однолетних). Широко распространен и щетинистый клубеньковый долгоносик. Ранней весной самки клубеньковых долгоносиков откладывают от 10 до 100 яиц. Через 10-15 дней из яиц развиваются небольшие, до 5,5 мм, червеобразные, согнутые, белые, со светло-бурой головкой личинки, питающиеся преимущественно клубеньками и корневыми волосками. Только что вылупившиеся личинки проникают в клубенек и питаются его содержимым. Более взрослые личинки разрушают клубеньки снаружи. Одна личинка за 30-40 дней уничтожает от 2 до 6 клубеньков. Особенно большой вред они наносят в сухую и жаркую погоду, когда развитие растений замедляется.

Клубеньки люцерны и некоторых других видов бобовых растений повреждает также большой люцерновый долгоносик. Самки жука откладывают до 400 яиц, из которых развиваются безногие, дугообразные, желтовато-белые, с бурой головкой, покрытые бурыми щетинками личинки. Их длина 10 — 14 мм. Цикл развития большого люцернового долгоносика протекает в течение двух лет.

Наличие нематод в корневой зоне различных видов бобовых растений отмечают многие исследователи. В прикорневой зоне гороха, например, обнаружено 47 видов нематод, среди них 25 паразитических. На корнях молодых растений фасоли, люпина, клевера может паразитировать широко распространенная ростковая нематода. Самки этого вида, питающиеся корнями растений, откладывают яйца в ткани растения. Весь жизненный цикл развивающейся из яиц нематоды протекает обычно внутри тканей. В степных районах на корнях люцерны, клевера и сои обнаружена степная нематода. Самки перед откладкой яиц проникают в корень, куда откладывают от 12 до 20 яиц. В корнях личинки проходят три личиночные стадии развития, нарушая функции корня и клубеньков.

 Распространение клубеньковых бактерий в природе

Являясь симбиотическими организмами, клубеньковые бактерии распространяются в почвах, сопутствуя определенным видам бобовых растений. После разрушения клубеньков клетки клубеньковых бактерий попадают в почву и переходят к существованию за счет различных органических веществ подобно другим почвенным микроорганизмам. Почти повсеместное распространение клубеньковых бактерий является доказательством высокой степени их приспособляемости к различным почвенно-климатическим условиям, способности вести симбиотический и сапрофитный способ жизни.

В целинных и окультуренных почвах присутствуют обычно в больших количествах клубеньковые бактерии тех видов бобовых растений, которые имеются в составе дикой флоры или культивируются длительное время в данной местности. Численность клубеньковых бактерий всегда наивысшая в ризосфере бобовых растений, несколько меньше их в ризосфере других видов и мало в почве вдали от корней.

В почвах встречаются как эффективные, так и неэффективные клубеньковые бактерии. Имеется много данных о том, что длительное сапрофитное существование клубеньковых бактерий, особенно в почвах с неблагоприятными свойствами (кислых, засоленных), ведет к снижению и даже утрате активности бактерий.

Перекрестная заражаемость разных видов бобовых растений нередко приводит в природе и сельскохозяйственной практике к появлению на корнях клубеньков, недостаточно активно фиксирующих молекулярный азот. Это, как правило, зависит от отсутствия в почве соответствующих видов клубеньковых бактерий. Особенно часто такое явление наблюдается при использовании новых видов бобовых растений, которые либо заражаются неэффективными видами бактерий перекрестных групп, либо развиваются без клубеньков.

Клубеньки у растений, не относящихся к бобовым

Корневые клубеньки или образования, напоминающие клубеньки, широко распространены на корнях не только бобовых растений. Они обнаружены у голосеменных и покрытосеменных двудольных растений. Имеется до 200 видов различных растений, связывающих азот в симбиозе с микроорганизмами, образующими клубеньки на их корнях (или листьях).

Клубеньки голосеменных растений (порядки Cycadales — саговники, Ginkgoales — гинкговые, Coniferales — хвойные) имеют ветвящуюся коралловидную, сферическую или четковидную форму. Они представляют собой утолщенные, видоизмененные боковые корни. Природа возбудителя, вызывающего их образование, до сих пор не выяснена. Эндофиты голосеменных растений относят и к грибам (фикомицетам), и к актиномицетам, и к бактериям, и к водорослям. Некоторые исследователи предполагают существование множественного симбиоза. Например, считают, что у саговников в симбиозе принимают участие азотобактер, клубеньковые бактерии и водоросли. Также не решен вопрос и о функции клубеньков у голосеменных. Ряд ученых пытается в первую очередь обосновать роль клубеньков как азотфиксаторов. Некоторые исследователи рассматривают клубеньки подокарповых как резервуары воды, а клубенькам саговников нередко приписывают функции воздушных корней. У ряда представителей покрытосеменных двудольных растений клубеньки на корнях были обнаружены свыше 100 лет назад.

Среди растений, образующих на корнях клубеньки деревья, кустарники и полукустарники (семейства Coriariaceae, Myricaceae, Betulaceae, Casuarinaceae, Elaeagnaceae, Rhamnaceae), входящих в эту группу. Клубеньки большинства представителей данной группы — коралловидные гроздья розово-красного цвета, с возрастом приобретающие коричневую окраску. Имеются данные о наличии в них гемоглобина. У видов рода Elaeagnus (лоховые) клубеньки белого цвета.

Нередко клубеньки имеют большие размеры. У казуарин (Casuarina) они достигают в длину 15 см. Функционируют несколько лет. Растения с клубеньками распространены в разных климатических поясах или приурочены к определенному ареалу. Так, Shepherdia и Ceanothus встречаются только в Северной Америке, Casuarina — преимущественно в Австралии. Значительно шире распространены лоховые и облепиха.

Многие растения рассматриваемой группы произрастают на бедных питательными элементами почвах — песках, дюнах, скальных породах, болотах. Подробнее всего изучены клубеньки ольхи (Alnus), в частности A. glutinosa, обнаруженные еще в 70-х годах прошлого столетия М. С. Ворониным – рисунок 35. Существует предположение, что клубеньки свойственны не только современным, но и вымершим видам ольхи, поскольку их находили на корнях ископаемой ольхи в третичных отложениях долины реки Алдана — в Якутии.

Эндофит в клубеньках полиморфен. Он обычно встречается в виде гиф, везикул и бактероидов – рисунок 36. Таксономическое положение эндофита до сих пор не установлено, поскольку многочисленные попытки выделить его в чистую культуру оказывались бесплодными, а если и удавалось выделить культуры, они оказывались невирулентными.

Основное значение всей этой группы растений, по-видимому, заключается в способности фиксировать молекулярный азот в симбиозе с эндофитом. Произрастая в областях, где разведение сельскохозяйственных растений с точки зрения экономики нерационально, они играют роль пионеров в освоении земли. Так, ежегодная прибавка азота в почве дюн Ирландии (мыс Верде) под посадками Casuarina equisetifolia достигает 140 кг/га. Содержание азота в почве под ольхой на 30-50% выше, чем под березой, сосной, ивой. В высушенных листьях ольхи азота вдвое больше, чем в листьях других древесных растений. По расчетам А. Виртанена, сделанным в 1962 году, роща ольхи (в среднем 5 растений на 1 м2) дает за 7 лет прибавку азота 700 кг/га.

Значительно реже клубеньки встречаются у представителей семейства Zygophyllaceae (парнолистниковые). Впервые они были обнаружены Б. Л. Исаченко в 1913 году на корневой системе Tribulus terrestris. Позднее клубеньки были найдены и у других видов якорцев. Большинство представителей семейства Zygophyllaceae — ксерофитные кустарники или многолетние травы. Они распространены в пустынях тропических и субтропических областей, растут и на песчаных дюнах, пустошах и болотах умеренного пояса. Некоторые тропические растения, например парнолистник ярко-красный, образуют клубеньки только при высокой температуре и низкой влажности почвы. Увлажнение почвы до 80% от полной влагоемкости препятствует формированию клубеньков. Как известно, у бобовых растений умеренного климата наблюдается обратное явление. При недостаточной влажности они не образуют клубеньков.

Клубеньки у растений семейства парнолистниковых различаются размерами и расположением на корневой системе. Крупные клубеньки обычно развиваются на главном корне и близко от поверхности почвы. Более мелкие находятся на боковых корнях и на большей глубине. Иногда клубеньки образуются на стеблях, если они лежат на поверхности почвы. Клубеньки у якорцев наземных на песках вдоль Южного Буга имеют вид мелких белых слегка заостренных или круглых бородавок. Они обычно покрыты сплетением грибных гиф, проникающих внутрь коры корня.

У парнолистника ярко-красного клубеньки представляют собой концевые утолщения боковых корней растений. В клубеньках обнаруживаются бактероиды; бактерии очень напоминают клубеньковые. Клубеньки тропических растений Tribulus cistoides твердые, округлые, около 1 мм в диаметре, соединены с корнями широким основанием, на старых корнях нередко мутовчатые. Чаще располагаются на корнях, чередуясь, с одной или с двух сторон/  Для клубеньков характерно отсутствие зоны меристемы. Подобное явление отмечается при образовании клубеньков у хвойных растений. Клубенек поэтому возникает за счет деления клеток перицикла стелы.

Гистологическое изучение клубеньков Tribulus cistoides на разных стадиях развития показало, что в них отсутствуют микроорганизмы. На основании этого, а также скопления в клубеньках больших количеств крахмала их считают образованиями, выполняющими функцию обеспечения растений запасными питательными веществами.

Клубеньки вейника лесного — сферические или несколько удлиненные образования до 4 мм в диаметре, плотно сидящие на корнях растений. Цвет молодых клубеньков чаще всего белый, изредка розоватый, старых -желтый и бурый. Клубенек связан с центральным цилиндром корпя широким сосудистым пучком.

 

Так же как и у Tribulus cistoides, клубеньки вейника имеют кору, коровую паренхиму, эндодерму, перициклическую паренхиму и сосудистый пучок.   Бактерии в клубеньках вейника лесного очень напоминают клубеньковых бактерий бобовых растений.

Клубеньки найдены на корнях капусты и редьки — представителей семейства крестоцветных. Предполагается, что их образуют бактерии, которые обладают способностью связывать молекулярный азот. Среди растений семейства мареновых клубеньки встречаются у кофейных Coffea robusta и Goffea klainii. Они дихотомически ветвятся, иногда уплощены и имеют вид опахала. В тканях клубенька встречаются бактерии и бактероидные клетки..

Клубеньки у растений семейства розанных были обнаружены на дриаде (куропаточьей траве). У двух других представителей этого семейства — Purshia tridentata и Cercocarpus betuloides — описаны типичные коралловидные клубеньки. Однако никаких данных о строении этих клубеньков и природе их возбудителя в литературе пет.

Из семейства вересковых можно упомянуть только одно растение — медвежье ушко (или толокнянка), имеющее клубеньки на корневой системе. Многие авторы считают, что это коралловидные эктотрофные микоризы.

У покрытосеменных однодольных растений клубеньки распространены среди представителей семейства злаковых: лисохвоста лугового, мятлика лугового, волоснеца сибирского и волоснеца солончакового. Клубеньки образуются на концах корней; бывают продолговатыми, округлыми, веретеновидными. У лисохвоста молодые клубеньки светлые, прозрачные или полупрозрачные, с возрастом приобретают бурую или черную окраску. Данные о наличии бактерий в клетках клубеньков разноречивы.

Внекорневые азотфиксирующие симбионты

Фиксация азота изучена не только в ризосфере, но и в фитоплане. Скорость азотфиксации здесь зависит от специфических условий на поверхности листьев разных видов растений. Как правило, среди листовых экссудатов содержатся углеводы – арабиноза, ксилоза, рамноза, глюкоза, фруктоза, галактоза, сахароза, лактоза, дульцит, манит, инозит; органические кислоты – щавелевая, янтарная, лимонная, малеиновая; аминокислоты – аспарагин, аргинин, глутаминовая кислота, норвалин, норлейцин, лизин, аланин, фенилаланин, цистеин, аминоуксусная кислота (всего до 92 мкг / 10 г сырой массы листа).

На поверхности листа определяются также неорганические вещества: большие количества соединений натрия и марганца, кальция, магния, серы, калия, иода, железа, цинка, фосфора и хлора. Казалось бы, высокое парциальное давление кислорода и высокий уровень азота должны ингибировать нитрогеназный комплекс, однако доказано, что численность диазотрофов, развивающихся в филлосфере в течение вегетационного периода, в среднем составляет 1,4 – 4,3 млн /г листьев различных растений. Интересно, что это становится возможным потому, что в сообществе микроорганизмов создаются совершенно другие, чем на всей поверхности листа, условия. Так, например, сапрофиты утилизируют различные соединения азота и снижают их содержание в среде, аэробные организмы потребляют кислород и уменьшают его концентрацию. Все это приводит к мгновенному «включению» нитрогеназы диазотрофов. Более того, обнаружен феномен развития клеток Azotobacter в петлях грибов, обитающих на поверхности листьев, клеток Pseudomonas – в капсулах дрожжей.

В эндоризосфере для азотфиксации создаются совершенно другие условия, поскольку около корня образуется муцигель – слизистый слой, содержащий полисахариды, пектины, свободные сахара. Эти вещества не подвергаются в этой зоне быстрому разложению потому, что вследствие низкой диффузии газов создаются анаэробные условия. В структуре ризоплановых ценозов преобладают микроаэрофильные формы диазотрофов, сам процесс азотфиксации здесь идет постоянно и монотонно, поскольку муцигель обладает буферными свойствами.

Известно свыше 400 видов различных растений, образующих клубеньки на листьях. Наиболее хорошо изучены клубеньки у Pavetta и Psychotria. Они располагаются на нижней поверхности листьев вдоль основной жилки или рассеяны между боковыми жилками, имеют интенсивный зеленый цвет. В клубеньках сконцентрированы хлоропласты и танин. При старении на клубеньках часто появляются трещины.

Сформировавшийся клубенек заполнен бактериями, инфицирующими листья растения, очевидно, в момент прорастания семян. При выращивании стерильных семян клубеньки не возникают и растения развиваются хлоро-тичными. Выделенные из листовых клубеньков Psychotria bacteriophyla бактерии оказались принадлежащими к роду Klebsiella (К. rubiacearum). Бактерии фиксируют азот не только в симбиозе, но и в чистой культуре — до 25 мг азота на 1 г использованного сахара. Надо полагать, что они играют немаловажную роль в азотном питании растений на малоплодородных почвах. Есть основания полагать, что они снабжают растения не только азотом, но и биологически активными веществами.

Иногда на поверхности листьев появляются глянцевые пленки или разноцветные пятна. Их образуют микроорганизмы филлосферы — особая разновидность эпифитных микроорганизмов, которые также участвуют в азотном питании растений. Бактерии филлосферы преимущественно олигонитрофилы (живут за счет ничтожных примесей азотсодержащих соединений в среде и, как правило, фиксируют небольшие количества молекулярного азота), тесно контактирующие с растением.

Везикулярно-арбускулярная микориза

Наиболее древней формой симбиоза растений с микроорганизмами является микориза (возникла 400-450 млн. лет назад, а бобово-ризобиальный симбиоз – 60-70 млн. лет назад), которая образуется при колонизации грибами корней растений. Микоризы образуются у 90 % видов наземных растений. При этом грибы являются посредниками между растениями и почвой, обеспечивая хозяев питательными веществами. Выделяют эндомикоризу (гифы гриба проникают внутрь клеток растений) и эктомикоризу (факультативна для обоих симбионтов).

Большое распространение имеет неспецифичная форма эндомикоризы – везикулярно-арбускулярная микориза (ВАМ), образуемая большинством наземных растений. ВАМ образуется под действием грибов-зигомицетов из порядка Glomales, для которых симбиоз является облигатной стадией. Для растений же ВАМ может быть как облигатным (многолетние формы и растения со слабо развитой корневой системой), так и факультативным. ВАМ растения в основном образуют при недостатке фосфора.

Развитие ВАМ можно разделить на три этапа: преинфекционные взаимодействия, формирование межклеточного мицелия, развитие внутриклеточной симбиотической структуры. На первом этапе споры гриба прорастают в почве под действием растительных выделений и образуют специальные структуры прикрепления – апрессории. Во втором этапе из апрессорий во внутрь корня начинает расти инфекционная гифа, проникая через эпидермис в ткани кортекса, ветвится и образует мицелий. На третьем этапе в местах тесного контакта мицелия с клетками гифы проникают в растительные клетки, где образуются арбускулы – разветвленные впячивания сложной формы, содержащие гифу гриба, окруженную растительной плазмалеммой и клеточной стенкой. Арбускулы являются местами наиболее интенсивного обмена партнеров метаболитами, в частности передачи в растение фосфатов, поглощаемых грибом из почвы. Арбускулы существуют в течение нескольких дней, после лизируются хозяином, а взамен гифы в кортексе корня образуют новые арбускулы.

Весь процесс образования ВАМ у растений контролируется комплексом симбиотических генов (например, SYM-8, SYM-19 и SYM-30 гены гороха), аналогичных nod-генам. У бобовых процесс образования и бобово-ризобильного симбиоза, и ВАМ контролируется одними и теми же генами (например, SYM гены гороха).

Мицелии Glomus fasciculatum в ВАМ переводят нерастворимые формы фосфатов в растворимые, обеспечивая растение фосфатами. Таким образом, грибы-зигомицеты из порядка Glomales могут быть использованы в сельском хозяйстве для обеспечения растений фосфатами.

Ризосферная микрофлора

Высшие растения, являясь основным источником питательных веществ для преобладающего числа микробного населения почв -гетеротрофов, — оказывают существенное влияние на микробные ценозы. Зоны, непосредственно примыкающие к корням живых растений, являются областями активного развития микроорганизмов. Это связано, прежде всего, с выделениями из корней (экзосмосом) органических веществ, синтезированных растениями. Совокупность микроорганизмов, содержащихся в большом количестве в узкой зоне вокруг корней, называют ризосферной микрофлорой, а саму зону -ризосферой.

Кроме того, существует представление о ризоплане — непосредственной поверхности корня, заселенной микробами. Ясно, что метаболизм (обмен веществ) корней оказывает большое влияние на почвенную среду, прилегающую к корням. Считают, например, что корни увеличивают кислотность примыкающих к ним микрослоев почвы за счет выделения углекислоты и Н+ионов. Такие изменения возможны в пределах нескольких миллиметров вокруг корня. Важным источником стимуляции почвенной микробиоты является выделение корнями питательных веществ.

Патогенные и симбиотические микроорганизмы привязаны к ним или способны растворять стенку клеток корня и проникать внутрь цитоплазмы. Экзосмос органических веществ из корней растений обусловлен активными процессами, пассивной диффузией или выделениями из отмирающих клеток. Молодые корешки обычно покрыты слизистыми чехликами, обильно заселенными микробами.

В продуктах экзосмоса корней обнаружено большое количество различных веществ, в том числе 10 разных сахаров, 23 аминокислоты, 10 витаминов, полисахаридные слизи, органические кислоты и другие вещества. Характер выделений зависит от вида и возраста растений. В настоящее время еще нет достаточных сведений о процессах корневого экзосмоса и использования веществ микроорганизмами в условиях природной нестерильной среды.

Сфера воздействия корней на микрофлору в почве определяется лишь приблизительно но увеличению числа микробов по мере приближения к поверхности корня. Большинство трупп микроорганизмов обнаруживается в большем числе в ризосфере (Р), чем в окружающей почве (П), что можно выразить отношением: Р/П.

Иллюстрации к этому положению приведены в таблице 13.

Не все бактерии одинаково реагируют на стимулирующее действие корней. Так, грамотрицательные бактерии явно лучше развиваются в ризосфере, чем грамположительные неспорообразующие бактерии. Способность бактерий заселять зону корня связана не только с выделяемым веществом, но и с отношением к физическим факторам, антагонизму.

Многие исследователи обнаружили, что бактерии, способные разлагать целлюлозу, растворять фосфаты, использовать белки и сахара, синтезировать витамины и бактериальные полисахариды, — являются типичными обитателями ризосферы. Удается также отметить некоторую корреляцию между таксономическими и физиологическими группами бактерий в ризосфере. Так, например, виды Pseudomonas доминируют в ризосфере, а виды Arthrobacter — в окружающей почве. Представители обоих родов заметно различаются по потребностям в ростовых факторах.

Таблица 13 — Сравнение числа бактерий и актиномицетов в ризосфере пшеницы и в контрольной почве

Организмы

Ризосферная почва

Контрольная почва

Р/П

Бактерии

Актиномицеты

1200*106

46*106

53*106

7*106

23

7

Группы бактерий:

Аммонификаторы

Газообразующие анаэробы

Анаэробы

Денитрификаторы

Аэробные целлюлозоразлагающие

Анаэробные целлюлозоразлагающие

Спорообразующие

500*106

39*104

12*106

126*106

7*105

9*103

930*103

4*106

3*104

6*106

1*105

1*105

3*103

575*103

125

13

2

1260

7

1

1

Меньше внимания уделялось актиномицетам, хотя их приуроченность к ризосфере установлена. Возможно, что в этих условиях они образуют активные вещества (антибиотики), угнетающие развитие патогенов на корнях. В этом вопросе остается много неясностей. По видовому составу и особенно физиологии виды актиномицетов, обитающие в ризосфере и в почве, не отличаются.

На микрофлору ризосферы влияют вид и возраст растений, их состояние, положение и характер распределения корней, тип почвы и окружение. Корни растений стимулируют или угнетают микробов в разной степени. Бобовые растения чаще всего стимулируют развитие микробов. В ризосфере клеверов, например, обнаруживается значительно больше микроорганизмов, чем в зоне корней злаков и деревьев.

Корневые выделения растений в случае длительного выращивания одних и тех же культур растений (монокультур) на одних и тех же площадях приводят к так называемому «почвенному утомлению». Такая обстановка в сочетании с монотонным по составу растительным опадом вызывает селекцию отдельных групп и даже видов микроорганизмов и их чрезмерное развитие в почвах. Следствием этого являются стойкие заболевания растений (при развитии патогенных для растений микробов), уносящие урожай. В пределах поверхности одного корешка микрофлора оказывается разной и обилие микроорганизмов нарастает к кончикам корней, где, например, отмечен наибольший экзосмос аминокислот.

Ризосферный эффект увеличивается после прорастания семени и достигает максимума в период цветения и плодоношения растений. Таким образом, возраст и старение растений играет большую роль в формировании и деятельности ризосферной микрофлоры.

Степень освещенности и температура воздуха также влияют на корневые выделения и, следовательно, на микроорганизмы. Ризосферный эффект более ярко выражен в песчаных почвах и менее — в гумусных. В пустынных районах ризосфера является, по-видимому, единственной зоной, где активно развивается микрофлора. В любой почве изменения окружающей среды, включая агротехнические мероприятия, оказывают меньшее воздействие на микроорганизмы в ризосфере по сравнению с обитателями почвы. Ризосферная зона представляет собой своеобразную «буферную» систему, препятствующую воздействию среды на микрофлору.

Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы

В 1901 году М. Бейеринк выделил из почвы аэробную неспорообразующую грамотрицательную бактерию, фиксирующую молекулярный азот, и назвал ее Azotobacter chroococcum (в родовом названии отражена способность бактерии фиксировать азот, в видовом — способность синтезировать коричневый пигмент — chroo и образовывать кокковидные клетки -coccum). Азотобактер — типичный представитель свободноживущих микроорганизмов. Свободноживущие — это все те микроорганизмы, которые живут в почве независимо от того, развивается вблизи растение или нет.

Культуры азотобактера в лабораторных условиях отличаются полиморфизмом. Клетки разных видов азотобактера в молодом возрасте показаны на рисунке 40.

clip_image014

1- Az. vinelandii; 2 – Az. chroococcum; 3 — Az. Agilus/

Рисунок 40 — Клетки — представители азотобактера, увеличение х1000. (по Г. Иенсену)

Молодые клетки азотобактера подвижны; они имеют многочисленные или единичные жгутики — рисунок 41.

clip_image016

1 — A. agilis, видны перитрихиалыше жгутики; 2 — A. macrocytogenes, видны полярные жгутики.

Рисунок 41 — Делящиеся клетки азотобактера (по А. Бейлю и др.)

У азотобактера обнаружены выросты, подобные фимбриям — рисунок 42.

Рисунок 42 — Фимбрпоподобные образования у клеток азотобактера. Увеличение х 24 000. (По Э. В. Болтянской.)

В старых культурах клетки азотобактера покрываются плотной оболочкой, образуя цисты. Они могут прорастать, давая начало молодым клеткам – рисунок 43.

clip_image018

1 — Прорастающая циста (растущая молодая клетка разрывает оболочку цисты; 2 — Зрелая циста, наполненная гранулами жира и окруженная толстой плотной.

Рисунок 43 — Цисты азотобактера (по И. Чану и др.). Увеличение х 35 000

Полиморфизм азотобактера зависит в значительной степени от состава среды, на которой он выращивается. На среде с этиловым спиртом (в качестве единственного источника углерода) азотобактер длительное время сохраняет подвижность и форму палочек. В то же время на многих других средах полиморфизм проявляется очень резко. На плотных питательных средах, не содержащих азота, азотобактер образует крупные слизистые, иногда морщинистые колонии – рисунок — 44, окрашивающиеся при старении в желтовато-зеленоватый, розовый или коричнево-черный цвет.

Рисунок 44 — Развитие колоний A. chroococcum вокруг комочков почвы на среде без азота

Колониям разных видов азотобактера присуща своя специфическая пигментация. К настоящему времени известен ряд видов азотобактера: Azotobacter chroococcum, Az. beijerinckii, Az. vinelandii, Az. agilis, Az. nigricans, Az. galophilum. Источником азота для азотобактера могут служить разнообразные минеральные (соли аммония, азотной и азотистой кислот) и органические (мочевина, различные аминокислоты) соединения. Однако если азотобактер развивается только за счет связанного в среде азота, он не выполняет своей основной функции — фиксации молекулярного азота. Азотобактер обычно фиксирует до 10-15 мг молекулярного азота на 1 г использованного источника углерода (например, глюкозы, сахарозы). Эта величина сильно колеблется в зависимости от условий выращивания культуры, состава питательной среды, ее кислотности, температуры, аэрации.

Азотобактер хорошо усваивает разнообразные углеводы (моно- и дисахара, некоторые полисахариды), органические кислоты, многоатомные спирты (глицерин, маннит) и другие вещества. Многим исследователям удавалось выращивать азотобактер в чашках с питательной средой без азота и углерода, если чашки были помещены в камеру, где находились пары ацетона, этилового спирта или некоторых других органических соединений. В присутствии легкодоступных форм углеродсодержащих соединений азотобактер может частично использовать углекислоту из атмосферы. Повышение концентрации углекислого газа до 0,5% в воздухе несколько стимулирует развитие азотобактера. Но азотобактером лучше усваиваются легкодоступные формы углеродсодержащих органических соединений. В почве запас подвижного органического вещества невелик, поэтому именно недостаток легкодоступных соединений углерода в первую очередь ограничивает развитие азотобактера в природных условиях.

Перегнойные вещества почвы азотобактером практически не усваиваются. Поэтому в почвах, даже очень богатых перегноем, при отсутствии свежих органических остатков интенсивного размножения азотобактера не происходит. Однако, если в почве имеются органические соединения и продукты распада растительных и животных клеток, азотобактер развивается хорошо. В частности, он усиленно размножается в почвах, удобренных соломой и соломистым навозом, а также в разнообразных компостах, содержащих целлюлозу. Азотобактер хорошо ассимилирует вещества, образующиеся при распаде целлюлозы.

Развитие азотобактера и фиксация им азота в значительной степени зависят от наличия в среде фосфора. Источником фосфора могут служить как органические, так и минеральные фосфорсодержащие соединения. Высокая чувствительность азотобактера к фосфору позволила разработать микробиологический метод определения потребности почв в фосфорных удобрениях. В качестве тест-организма в этом методе используется азотобактер. Микробиологические методы определения потребности почвы в удобрении имеют ряд преимуществ перед химическими анализами, хотя, безусловно, уступают в точности.

Важную роль в обмене веществ азотобактера играет кальций. Этот элемент необходим азотобактеру при питании как молекулярным, так и аммонийным азотом. Недостаток кальция в среде приводит к сильной вакуолизации клеток и их вздутию. Высокая чувствительность азотобактера к кальцию, так же как и к фосфору, используется для определения потребности почв в известковании.

Микроэлементы (молибден, бор, ванадий, железо, марганец) необходимы азотобактеру в первую очередь для осуществления процесса азотфиксации. Потребность в микроэлементах определяется в значительной степени геохимическими условиями существования азотобактера в почвах. Штаммы микроорганизма, выделенные из почв с высоким естественным содержанием того или иного микроэлемента, нуждаются, как правило, в более высоких концентрациях этих элементов.

Радиоактивные элементы (радий, торий, уран) оказывают стимулирующий эффект на развитие азотобактера и процесс азотфиксации. Азотобактер чрезвычайно чувствителен к реакции среды. Оптимальная для его развития область рН 7,2-8.2. Однако азотобактер способен развиваться и на средах с рН от 4,5 до 9,0; кислая реакция среды неблагоприятно действует на его развитие. Из кислых почв выделяются неактивные формы азотобактера, утратившие способность связывать молекулярный азот.

Большое влияние на развитие азотобактера оказывает влажность почвы. Клетки азотобактера имеют меньшее осмотическое давление, чем клетки грибов и актиномицетов; потребность во влаге аналогична потребности высших растений. Азотобактер распространен в пресных водоемах, илах, затопляемых рисовых полях, сточных водах, сильно увлажненных почвах, на водных растениях в прудах и водохранилищах. Это свидетельствует о его высокой гидрофильности. На основании значительной потребности во влаге почвенных форм азотобактера предполагается, что предки некоторых морских и почвенных видов азотобактера могли быть общими.

В отношении температуры азотобактер является типичным мезофильным организмом, с оптимумом развития около 25-30 °С. Понижение температуры азотобактер переносит хорошо, поэтому зимой даже в северных широтах численность его клеток в почве заметно не уменьшается.

Из биологических факторов, влияющих на развитие азотобактера, следует прежде всего отметить почвенные микроорганизмы. Они могут оказывать влияние на жизнедеятельность азотобактера в почве косвенно, изменяя, например, рН или окислительно-восстановительные условия, и непосредственно, вырабатывая питательные и биологически активные вещества. Так, активирующее влияние целлюлозоразрушающих и маслянокислых микроорганизмов на развитие азотобактера и его антагонистические отношения с представителями почвенной микрофлоры отмечали многие исследователи. Биоценоз микроорганизмов, формирующийся в условиях той или иной почвы, меняется в значительной степени под влиянием растительного покрова. И азотобактер как член биоценоза также зависит от этого фактора. С помощью метода радиоавтографии установлено, что при нанесении меченных по фосфору клеток азотобактера на семена зерновых культур клетки обычно концентрируются вокруг растущей корневой системы проростков.

Имеются, однако, данные, что клеток азотобактера в ризосфере растений очень мало. В самом лучшем случае (при полном отсутствии антагонистов и благоприятных окружающих условиях) их количество не превышает 1 % от общего числа ризосферной микрофлоры. Культуры азотобактера, как правило, образуют значительное количество биологически активных веществ: витамины группы В, никотиновую и пантотеновую кислоты, биотин, гетероауксин и гиббереллин. Однако, несмотря на то, что культуры азотобактера вырабатывают целую серию биологически активных веществ, внесение витаминов, гиббереллина и гетероауксина в среду ускоряет рост азотобактера. Реакция на дополнительное внесение витаминов в среду является индивидуальной особенностью штаммов.

Азотобактер может продуцировать ростовые вещества типа ауксинов. Это подтверждается опытами, в которых было установлено образование дополнительных корешков у черенков фасоли под влиянием ауксинов, вырабатываемых азотобактером. Биологический тест — карликовая форма гороха сорта Пионер — позволяет определить в культуре азотобактера гиббереллиноподобные соединения.

Все эти соединения в совокупности способны стимулировать прорастание семян растений и ускорять их рост в тех, конечно, случаях, когда на корневой системе растений находится достаточное количество клеток азотобактера. Кроме того, была обнаружена антагонистическая активность азотобактера по отношению к возбудителям бактериальных болезней растений. Азотобактер синтезирует фунгистатический (задерживающий развитие грибов) антибиотик группы анисомицина. Ряд грибных организмов, встречающихся на семенах и в почве (виды из родов Fusarium, Alternaria, Penicillium), может угнетать развитие многих видов растений, особенно в холодную погоду. Азотобактер, продуцируя противогрибные антибиотические вещества, помогает растениям расти и развиваться, что имеет особенно большое значение в ранние фазы развития.

К сожалению, способность азотобактера активно размножаться в почве и проявлять с: многогранные качества весьма ограничена из-за дефицита легкодоступных органических веществ в почве и высокой требовательности мироорганизма к условиям среды обитания. Поэтому стимулирующий эффект азотобактера проявляется лишь на плодородных почвах.

Распространение азотобактера в почвах имеет определенные закономерности. В целинных подзолах и дерново-подзолистых почвах, характеризующихся кислой реакцией, условия для развития азотобактера неблагоприятны. Только окультуривание таких почв создает возможности для его развития. В почвах с повышенным увлажнением и преобладанием луговой растительности (почвы пойм) азотобактер обычно встречается в течение всего вегетационного периода в больших количествах. В торфяниках азотобактер или отсутствует, или развивается очень слабо. В зоне достаточно увлажненных северных мощных черноземов азотобактер развивается хорошо, а в зоне обычных и южных черноземов при отсутствии орошения, а также в целинных и неполивных окультуренных каштановых почвах только как весенний эфемер.

Некоторые представители микроорганизмов, обеспечивающих фиксацию молекулярного азота приведены в приложении В.

Ассоциативные азотфиксаторы

Ассоциативные азотфиксаторы, принадлежащие к различным родам и видам, имеют индивидуальные особенности в анатомическом строении, физиологии, биохимии и, естественно, в процессах взаимоотношения с растением. Разнообразие ассоциативных взаимоотношений растений с микроорганизмами очень велико. Часто микробиологи не делают различия между ассоциативными и свободноживущими азотфиксаторами.

Однако ассоциативные взаимоотношения касаются, прежде всего, так называемых ризосферных микроорганизмов, то есть тех микроорганизмов, которые живут на поверхности корневой системы растений. Микробы как бы колонизируют поверхность корневой системы. При этом просматриваются черты взаимоотношений, напоминающие взаимоотношения с растением симбиотических азотфиксаторов. Имеются те же этапы: хемотаксическое узнавание, лектин-углеводное узнавание и этапы установления прочных связей, обусловленные обменом веществ, полезным и растению, и микроорганизмам. При этом отсутствует этап образования клубеньков.

Эффективность азотфиксации ассоциативной микрофлорой, по сравнению с симбиотической, не столь велика, однако у ассоциативных азотфиксаторов имеются важные свойства, позволяющие помочь растению в его росте и развитии (синтез фитогормонов, защита от фитопатогенов, разрушение токсических веществ).

Из числа хорошо изученных азотфиксаторов выделяются микроорганизмы рода азоспирилл. Они очень интересны, так как колонизируют корни злаков и могут быть полезны в технологии их выращивания. Азоспириллы, впервые выделенные М. Бейеринком в 1925 году в виде Spirillum lipoferum Beijerinckii, были вновь открыты доктором Дж. Доберейнер в 1976 году и с тех пор благодаря ее инициативе быстро попали в сферу интенсивного изучения.

Очень интересны ассоциативные взаимоотношения синезеленых водорослей с водным папоротником азоллой, растущим в воде рисовых полей Вьетнама, Китая, Индонезии. Естественно, что биология этого явления и особенности самих синезеленых водорослей имеют свою специфику и привлекают к себе внимание многих биологов и технологов-рисоводов. Грань между симбиозом и ассоциативностью при анализе многих азотфиксирующих пар растение – микроорганизм размыта.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *