Механизм биологической фиксации молекулярного азота, иммобилизация фосфора микроорганизмами


Механизм биологической фиксации молекулярного азота

 

Атомы в молекуле азота (N2) соединены тремя ковалентными связями, энергия диссоциации которых равна 9,4 • 105 дж/молъ. Наибольшей энергией — 5,3•105 дж/молъ — обладает первая связь, вторая — 2,5•105 дж/молъ, третья — 1,6 • 105дж/молъ. Эти связи очень прочны, в связи, с чем молекулы азота химически инертны. Именно инертность азота обусловливает необходимость его активации, так же как и повышения химической активности вступающего с ним в реакцию соединения или элемента.

Синтез аммиака из атмосферного азота химическим путем, осуществляемый методом Габера — Боша, происходит при температуре 400 — 500 °С и высоком давлении (200-1000 атм). Клетки микроорганизмов проводят процесс азотфиксации в обычных условиях. У азотфиксаторов, как показал В. Л. Кретович, интенсивность энергии обмена, в частности степень потребления кислорода, значительно выше, чем у бактерий, неспособных фиксировать азот. Также у них более активны ферменты. Однако, каким путем эта энергия используется в процессе азотфиксации, до настоящего времени еще точно не установлено.

В современных гипотетических схемах механизма азотфиксации несомненное предпочтение отдается восстановительному характеру превращений молекулярного азота, о чем в 20-е годы этого столетия утверждали С. П. Костычев и С. Н. Виноградский, выдвигая «аммиачную теорию» фиксации атмосферного азота. У всех свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов, а также и при симбиотической азотфиксации аммиак (NH3) обнаружен в качестве первого стабильного продукта этого процесса.

Наиболее вероятно, что разрыв связей в молекуле азота происходит не сразу, а последовательно, в результате действия ферментных систем. В. Е.Шилов и Г.И.Лихтенштейн (1971) предложили механизм активации азота ферментом нитрогеназой. Молекулярный азот через щель размером 4-5 ангстрем, что соответствует длине молекулы азота, поступает внутрь фермента и здесь активируется. В его активации большая роль принадлежит молибдено- и железосодержащим центрам, по цепям атомов которых происходит эстафетная передача активирующих азот электронов от восстановителя. Реакции активации способствует близость группировок серы.

В результате активации и хемосорбции азота нитрогеназой высвобождается энергия и происходит разрыв двух связей в молекуле азота. На это расходуется 7,8*105дж/моль. Третья связь разрывается при внедрении в молекулу активированного азота: водорода, активированного, в свою очередь, ферментами дегидрогеназной и гидрогеназной систем. Получающийся аммиак или другие восстановленные продукты азота реагируют с кетокислотами, образуя аминокислоты.

В.С. Шевелуха с соавторами приводят следующую схему нитрогеназной активности, сопровождающей фиксацию азота – рисунок .46. На схеме показано, что он состоит из трех типов белков (α, β и γ) и двух кофакторов: молибден-железо-(MoFe)-содержащего и железо (Fe)-содержащего. Нитрогеназа состоит из двух субъединиц: большой — динитрогеназы, в состав которой входит MoFe-кофактор (которую также называют компонентом 11) и малой – редуктазы динитрогеназы, содержащей Fe-кофактор (компонент 1).

Восстановление молекул азота происходит при ее взаимодействии с MoFe-кофактором (см. рисунок 45), то есть на динитрогеназе. Функция редуктазы заключается в передаче электронов на динитрогеназу. Ионы железа входят в состав обоих компонентов в геминовой (редуктаза динитрогеназы) или негеминовой (динитрогеназа) формах.

Несмотря на сложность структуры, нитрогеназа обладает низкой субстратной специфичностью: она способна восстанавливать широкий спектр соединений с тройной связью, в том числе превращать ацетилен в этилен. Суммарная реакция, катализируема нитрогеназой, выражается уравнением:

N2 + 8H+ + 8e + 16ATФ = 2NH3 + H3 + 16АДФ +16Фн

Большое количество молекул АТФ, необходимых для реакции, показывает ее высокую энергоемкость, которая гораздо выше, если учесть энергетические затраты на синтез нитрогеназы и обслуживающих ее ферментов. Подсчитано, что для фиксации 1 г азота необходимо затратить 100-200 г глюкозы, поэтому понятно, что азотфиксация будет происходить при дефиците доступных форм азота и достаточных источниках энергии.

clip_image002

nif H – ген, кодирующий структуру γ-белков нитрогеназы; nif K– ген, кодирующий структуру β -белков нитрогеназы; nif D – ген, кодирующий структуру α -белков нитрогеназы.

Рисунок 46 — Структура и функции нитрогеназы (по В.С. Шевелуха с соавт)

Наиболее эффективным источником энергии для микроорганизмов являются окислительное фосфорилирование и фотосинтез. Однако нитрогеназа очень чувствительна к свободному кислороду и необратимо инактивируется даже при небольших концентрациях кислорода, что затрудняет сопряжение аэробных энергетических процессов и фиксации азота. Поэтому у микроорганизмов-азотфиксаторов появились различные механизмы, позволяющие решать эту проблему. У свободноживущих диазотрофов это достигается либо тем, что гены, кодирующие нитрогеназу, активизируются только в анаэробных условиях или микроаэрофильных условиях (свободноживущие эубактерии, архебактерии), либо тем, что азотфиксирующие клетки образуют плотную оболочку, которая очень медленно пропускает кислород (гетероцисты цианобактерий). В симбиотических системах, функцию защиты нитрогеназы от кислорода выполняет, как правило, хозяин.

Синтез и созревание нитрогеназы кодируется сложной системой

nif-генов, многие из которых являются общими для всех азотфиксаторов. У наиболее изученного из них – энтеробактерии Klebsiella pneumoniae – эта система включает 25 генов, собранных в единый кластер и организованных в семь транскрипционных единиц. Гены nif H, nif D, nif K кодируют структуру γ-, α- и β-белков нитрогеназы; гены nifМ, nifS, nifU, nifY – процессинг этих белков. Специальная группа генов – nifВ, nifЕ, nifN, nifV – контролирует синтез MoFe-кофактора. Помимо генов, кодирующих структуру компонентов нитрогеназного комплекса, nif — оперон Klebsiella содержит два регуляторных гена, nifА кодирует белок, активирующий транскрипцию генов nifHDK и других nif-генов, а продукты nif гена nifL репрессируют транскрипцию nif-генов в присутствии кислорода или связанного азота. У многих азотфиксаторов nifL отсутствует, и его функцию выполняют другие гены.

Преинфекционные (сигнальные) взаимодействия

Развитие бобово-ризобиального симбиоза — сложный многостадийный процесс, который включает четыре группы процессов:

— ранние (преинфекционные) взаимодействия;

— морфогенез клубеньков;

— регуляция развития эндосимбионтов;

— функционирование клубеньков, как органов азотфиксации.

Все эти процессы находятся под контролем взаимодействующих организмов – растения-хозяина и микроорганизмов. Обмен партнеров молекулярными сигналами происходит при любых симбиотических взаимодействиях. На ранних этапах симбиоза это обеспечивает переход организмов из свободноживущего в симбиотическое состояние, на более поздних – метаболические и морфогенетические процессы, обеспечивающие функционирование симбиоза. Сигналы часто действуют на уровне транскрипции и трансляции генов-мишеней.

Образование симбиоза клубеньковых бактерий начинается с реакции ризобий на растительные флавоноиды, которые активируют бактериальные гены вирулентности nod (от англ. nodulation – клубенькообразование). На рисунке 47 показана структура nod- факторов ризобий, показаны наиболее важные заместители – ацильная группа на нередуцирующем конце (С18:1 или С18:4) и варианты заместителей в позиции R5 на редуцирующем конце.

clip_image004

Рисунок 47 — Структура nod-факторов ризобий (по В.С. Шевелуха с соавт.)

Под контролем этих генов ризобии синтезируют липо-хито-олигосахаридные nod-факторы, которые инициируют ранние стадии развития клубеньков. К настоящему времени известно более 50 генов вирулентности у ризобий. Некоторые из этих генов одинаковы, как структурно, так и функционально, для разных ризобий, другие специфичны для каждого вида или даже штамма.

Мутации в одинаковых nod-генах (nodА, nodВ, nodС) приводят к нарушению самой ранней стадии развития симбиоза – скручивания корневых волосков. При мутациях генов хозяйской специфичности (nodH, nodP, nodQ, nodZ, nodX) обычно нарушаются более поздние стадии взаимодействия, связанные с формированием инфекционных нитей и клубеньковых меристем. Важные различия между этими группами генов вирулентности выявляются и при переносе их между разными видами ризобий.

Перенос генов хозяйской специфичности обычно приводит к тому, что штамм-реципиент приобретает способность формировать клубеньки у растений–хозяев штамма-донора. При переносе одинаковых, неспецифичных nod-генов такого эффекта не наблюдается, однако, если реципиентом является вирулентный мутант с нарушением собственных nod-генов, одинаковых для разных видов, то у него наблюдается восстановление способности формировать клубеньки на исходных растениях-хозяевах.

Гены обеих групп являются индуцибельными: их активность первоначально удавалось зарегистрировать только после попадания ризобий в ризосферу растения. При этом флавоноиды, выделяемые в почву семенами или корнями бобовых, взаимодействуют с бактериальным белком NodD, который в результате приобретает способность активировать транскрипцию остальных nod-генов (nodD – единственный конститутивно работающий ген вирулентности ризобий).

Белок NodD связан с внутренней мембраной ризобиальной клетки, через которую проникают флавоноиды. Взаимодействуя с ним, белок NodD изменяет свою конформацию, в результате чего становится возможным его связывание с консервативной последовательностью «nod-box», расположенной в промоторах индуцибельных генов вирулентности. В результате повышается сродство этих промоторов к РНК-полимеразе и индуцируется их транскрипция. Схема обмена сигнальными молекулами между горохом и бактерией Rhizobium leguminosarum приведена на рисунке 48.

clip_image006

Рисунок 48 — Схема обмена сигнальными молекулами между горохом и бактерией Rhizobium leguminosarum (по В.С. Шевелуха с соавт)

Как показано на рисунке, корни растений выделяют специфические флавоноиды, которые в комплексе с бактериальным белком NodD активизируют синтез бактериальных сигнальных молекул — Nod-факторов. Их биосинтез кодируется nod-генами, расположенными на Sym-плазмиде.

Конечным продуктом действия генов вирулентности являются Nod-факторы, способность к синтезу которых – уникальное свойство ризобий. Эти факторы представляют собой модифицированные синтезируют липо-хито-олигосахариды, которые состоят из 3-6 остатков N-ацетилглюкозамина и радикала ненасыщенной жирной кислоты, содержащего 16-20 атомов углерода – рисунок 47.

Биосинтез этих факторов включает процессы:

— полимеризация N-ацетилглюкозамина (синтезируемых из фукозы под контролем белка NodМ) с образованием 1—4-β-гликозидных связей. Эта реакция, катализируемая белком NodС, приводит к образованию олигомеров хитина;

— деацетилирование «нередуцирующего» концевого остатка глюкозамина в положении R1 (катализируется белком NodВ) и последующее присоединение к атому азота жирнокислотного остатка (катализируется белком NodА);

— модификация образовавшегося липо-хито-олигосахарида (коровая часть Nod-фактора): атомы водорода на «редуцирующем» и «нередуцирующем» концах замещаются на различные радикалы (фукозил, сульфат, метил, ацетил и др.) – рисунок 49.

clip_image008

GlcNac — N-ацетилглюкозамин; GDP-Fucose — гуанозиндифосфо- фукоза; Acetyl Coa — ацетил-кофермент; PAPC 31-фосфоаденозин-51-фосфосульфат; SAM – S-аденозил-метионин.

Рисунок 49 — Биосинтез Nod-факторов (по В.С. Шевелуха с соавт.)

Приведенные стадии биосинтеза Nod-факторов контролируются разными группами nod-генов: синтез коровой части происходит под контролем «общих» nod-генов, а его модификация – под контролем генов хозяйственной специфичности. Очищенные Nod-факторы в концентрации всего 10-8— 10-12 М инициируют ранние стадии формирования симбиоза, скручивание корневых волосков, закладку клубеньковых меристем, а у некоторых бобовых, даже начальные стадии гистогенеза клубеньков. Отмечено, что Nod-факторы – это те сигналы, которые в значительной степени определяют специфичность всего процесса симбиотического взаимодействия. Наибольшую роль в этом играют модификации Nod-факторов, осуществляемые под под контролем генов хозяйственной специфичности.

Синтез и фенотипические эффекты Nod-факторов достаточно изучены, так как выделяются бактериями в среду, и их действие может быть легко промоделировано в системах in vitro. В меньшей степени изучены процессы рецепции бактериального сигнала и его последующей передачи в растении. В настоящее время показано, что перенос генов, контролирующих синтез некоторых фракций корневых лектинов, между разными бобовыми может сопровождаться расширением симбиотической специфичности. Выявлены фракции корневых лектинов бобовых, которые специфически связываются с Nod-факторами in vitro и при этом важны для образования симбиоза (обработка корней антителами, полученными на данные лектины, блокируют образование клубеньков). По-видимому, растительные лектины являются по меньшей мере одним из компонентов системы рецепции Nod-факторов.

Структурная основа симбиоза

Клубеньки бобовых растений выполняют комплекс взаимосвязанных функций, обеспечивая экологическую нишу для эндосимбионтов, создавая структурную основу для обмена партнерами метаболитами, а также осуществляя контроль численности и активности бактерий. Развитие клубеньков базируется на сигнальных процессах, вызывающих дифференциальную экспрессию генов. В случае симбиоза эти процессы связаны с экзогенными сигналами, поступающими от другого организма. Кроме того, формирование клубеньков является для растений факультативным, не обязательным для нормального развития и репродукции, при этом основная генетическая информация, необходимая для морфогенеза клубеньков, находится в геноме ризобий.

Среди наиболее изученных клубеньков «недетерменированного стеблевого» типа — представители бобовых – горох, клевер, люцерна. На рисунке 50 показано развитие азотфиксирующего клубенька гороха.

clip_image010

Рисунок 50 — Развитие азотфиксирующего клубенька гороха (по В.С. Шевелуха с соавт.)

Инфицирование этих бобовых ризобиями происходит через корневые волоски, которые при этом скручиваются, как это показано на рисунке. В месте наиболее резкого сгиба волоска происходит гидролиз клеточной стенки и глубокая инвагинация плазмалеммы, в которой участвуют мембранные структуры растительной клетки (аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум), происходит не активное внедрение бактерий в корневые волоски, а скорее захват ими бактерии-симбионта. В результате этих событий вокруг бактериальных клеток образуется особое пространство, называемое инфекционной нитью, стенки которого сходны со стенками растительных клеток, а внутреннее пространство заполняется веществом, в образовании которого участвуют оба партнера.

Параллельно с описанным выше процессом происходит закладка клубеньковой меристемы, связанная с митотической реактивацией, дифференцировкой и пролиферацией клеток кортекса, индуцируемой Nod-факторами. в возникающем клубеньковом примордии начинаются процессы гистогенеза, в результате чего формируются покровная, проводящая и азотфиксирующая ткани клубенька. Развивающаяся инфекционная нить, через 2-3 суток после инокуляции достигает основания корневого волоска, проникает в кортекс, а затем и в растущий клубенек, где разрастается и ветвится.

Ключевой стадией развития эндосимбиоза является переход бактерий из инфекционной нити в растительные клетки, происходящий путем эндоцитоза. В месте впячивания инфекционной нити в растительную ткань образуются временные структуры – инфекционные капли, от которых отшнуровываются мембранные пузырьки, содержащие бактерии. Таким образом, бактерии никогда не располагаются свободно в растительной цитоплазме – они заключены в «перибактероидные» мембраны, которые образуются с участием телец аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума, однако содержат и бактериальные белки. Бактериальная клетка или группа клеток, окруженные такой мембраной выделяются как основная субклеточная единица симбиоза – симбиосома.

Некоторое время после выхода из инфекционной нити ризобии сохраняют свои размеры и палочковидную форму, а затем дифференцируются в особые формы – бактероиды, которые, как уже отмечалось, значительно превосходят по размерам свободноживущие бактерии, а их форма варьирует от шарообразной и грушевидной у клевера до Y- или Х-образной у гороха.

Дифференциация бактерий связана репрессией многих генов, которые необходимы для автономного роста. Эта репрессия настолько глубока, что бактероиды уже не могут превращаться в свободноживущие клетки и гибнут после отмирания клубеньков. В бактероидах активируется синтез нитрогеназы, катализирующей восстановление молекулярного азота до аммонийной формы, а также других ферментов, обслуживающих нитрогеназную реакцию, после чего начинается фиксация атмосферного азота. Гистологическая структура клубенька недетерменированного типа в его развитии показана на рисунке 51.

clip_image012

Рисунок 51 — Гистологическая структура клубенька недетерменированного типа (по В.С. Шевелуха с соавт.)

Параллельно с формированием симбиосом происходит и дифференцировка инфицированных растительных клеток. Она выражается в возрастании количества внутриклеточных мембранных структур, которые участвуют в формировании перибактероидных мембран и в биосинтетических процессах. Для инфицированных клеток характерна полиплоидизация и декоденсация хроматина, связанная с усилением транскрипционной активности. На биохимическом их дифференцировка выражается в синтезе de novo ряда белков.

Этот процесс завершается формированием сложно устроенного клубенька «недетерменированного» типа. Его основными структурами являются:

— инфицированная бактериями ткань, в которой происходит фиксация молекулярного азота;

— проводящие пучки, по которым поступают растительные продукты фотосинтеза и выносятся продукты азотфиксации;

— апикальная меристема, за счет которой происходит рост клубенька. Она обеспечивает постоянное обновление азотфиксирующей ткани

Механизм взаимодействия растения и азотфиксатора

В симбиотических азотфиксирующих системах фиксация азота осуществляется в результате сложного взаимодействия микроорганизма и высшего растения. Несомненно, механизм процесса азотфиксации в клубеньках имеет своеобразные особенности, обусловленные совместным функционированием двух совершенно различных по своим свойствам партнеров, присутствием леггемоглобина, принимающего участие в процессе фиксации, и наличием бактероидов.

Процесс фиксации в симбиотической системе иллюстрируется схемой — рисунок 52, где видно, что растение и бактерии функционируют в единстве и что электрон-транспортной цепью между ними является леггемоглобин.

Высшее растение по схеме является источником углеродсодержащих соединений. Их трансформация обеспечивает получение энергетического материала для процессов активации и восстановления N2. Активированный азот — конечный акцептор электронов. Продукты неполного окисления углеродсодержащих соединений служат акцепторами NH3и в клубеньках образуют аминокислоты, которые становятся доступными высшему растению. Растения выполняют роль накопителя углеродсодержащих соединений (продуктов фотосинтеза) и поставщика энергии.

Клубеньковые бактерии в стадии бактероидов проявляют способность с помощью нитрогеназы переносить активированный водород к азоту. Путь от N2 до NH3рассматривается как восстановительный процесс. В последнее время получены доказательства локализации процесса азотфиксации в бактероидах с помощью измерения азотфиксирующей активности у фракции бактероидов, которую отделяли центрифугированием от других фракций клубенька.

Энергетическое обеспечение азотфиксации

Основным источником энергии для симбиотической азотфиксации, служит фотосинтез растения хозяина. Продукты фотосинтеза транспортируются в клубеньки преимущественно в виде сахарозы. Затем растение осуществляет анаэробный этап катаболизма сахарозы (гликолиз), в ходе которого вырабатывается относительно небольшое количество энергии.

На долю микросимбионта приходится выполнениеболее выгодной энергетической части катаболизма – цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). Основными углеводами, поступающими в бактероиды от растения-хозяина, являются С4–дикарбоновые кислоты – главным образом сукцинат и малат., которые непосредственно включаются в ЦТК.

Поэтому интенсивность работы нитрогеназной системы бактероидов в значительной степени определяется генами, обеспечивающими транспорт дикарбоновых кислот в бактероиды. Основную роль в этом процессе играют три гена: dctA (кодирует мембранную сукцинат-пермеазу), dctB и dctD (кодируют белки двухкомпонентной регуляторной системы, определяющие транскрипцию dctA). Белок DctВ является сенсором, встроенным в мембрану бактероидов и реагирующим на присутствие дикарбоновых кислот, а DctD взаимодействует с промотором гена dctA, облегчая посадку на него РНК-полимеразы. Система транспорта дикарбоновых кислот является одним из «узких мест», лимитирующих интенсивность симбиотической азотфиксации.

Со стороны растения-хозяина энергетика клубеньков обеспечивается синтезом клубенек-специфичных изоформ ферментов С-метаболизма – рисунок 53. среди них одно из центральных мест занимает сахарозосинтетаза (SS), гидролизующая сахарозу с участием уридиндифосфата. Образующиеся в результате гидролиза гексозы (глюкоза и фруктоза) претерпевают обычный путь катаболизма – гликолиз. Альтернативный путь – пентозофосфатный цикл, по-видимому, имеет в клубеньках второстепенное значение.

Так как количество углерода в клубеньках является одним из основных факторов, лимитирующих азотфиксацию, важное значение приобретает нефотосинтетическая (темновая) фиксация углекислого газа, катализируемая фосфоенолпируваткарбоксилазой (PEPC):

Фосфоенолпируват + СО2= малат.

Эта реакция – источник около четверти атомов углерода, поступающих в составе малата и других энергетических субстратов в бактероиды. Таким образом за счет работы PEPC рециклизируется существенная часть двуокиси углерода, выделяемой при дыхании, которое в клубеньках идет очень активно.

Ассимиляция фиксированного углерода

Органические соединения, поступающие в клубеньки, являются не только источниками энергии для азотфиксации, но и углеродных «заготовок, структур» для ассимиляции фиксированного азота. Образовавшийся в процессе азотфиксации аммоний поступает из бактериоидов в цитоплазму растительных клеток клубенька либо в свободной форме, либо в составе аланина (который образуется из-за

clip_image014

SSase– сахарозосинтаза, PEP — фосфоенолпируват, PEPCase — фосфоенолпируваткарбоксилаза, OA — оксалоацетат, MDH — малатдегидрогеназа, DctA — сукцинатпермеаза, GS — глутаминсинтетаза, GOGAT — глутаматсинтаза, dcA — дикарбоновые кислоты (малат, сукцинат), TCA — цикл трикарбоновых кислот, GLU — глутамин, GLN — глутамат, αketoGLU – α-кетоглутарат, FixGHIS и FixNOQP — специфические для бактероидов цитохромы с высоким сродством к кислороду, PBM — перибактероидная мембрана, BM — мембрана бактероида.

Рисунок 53 – Метаболическая интеграция партнеров при образовании азотфиксирующего симбиоза (по В.С. Шевелуха с соавт.)

активности бактериальной аланин-дегидрогеназы. Фиксированный азот включается и в метаболизм растительной клетки. В этом процессе различают стадии первичной ассимиляции азота (вовлечение аммония в клеточный метаболизм), образование транспортных форм фиксированного азота (которые поступают из клубеньков в проводящую систему корня) и транслокации фиксированного азота (его перераспределение между разными органами растения). В первичной ассимиляции и образовании транспортных форм фиксированного азота ключевую роль играют клубенек-специфичные формы ферментов азотного обмена, синтезируемые растением.

В растительных клетках усвоение аммония начинается реакциями, которые контролируются ферментами «глутаматсинтазного цикла» — глутаминсинтетазой (GS) и NADH – зависимой глутаматсинтазой (NADH-GOGAT). Вторым ферментом глутаматсинтазного цикла является NADH-GOGAT, локализованная, в отличие от клубенек-специфичной GS, в пластидах растительных клеток.

Помимо глутамина, главной транспортной формой азота у большинства бобовых, произрастающих в умеренных широтах (гороха, люцерны и др.), являются амиды – в основном, аспарагин. Эти бобовые выделяют в «амидный» тип. У других бобовых ( фасоль, соя) транспорт азота происходит в виде уреидов – аллантоина и аллантоиновой кислоты. Эти бобовые относят к «уреидному» типу.

У «амидных» бобовых все основные реакции усвоения фиксированного азота происходят в тех же клетках, которые содержат симбиосомы. При этом важную роль играет аспартатаминотрансфераза (ААТ), которая катализирует реакцию образования аспартата – предшественника аспарагина. В метаболизме «уреидных» клубеньков важную роль играет уриказа. Она осуществляет один из конечных этапов биосинтеза уреидов – образование аллантоина путем окисления мочевой кислоты, образующейся при окислении пуринов.

Иммобилизация фосфора микроорганизмами

Биогеохимия фосфора очень сильно отличается от биогеохимии других биофильных элементов – углерода, кислорода, азота, серы. Газообразная форма этих соединений является обязательным звеном в их биогеохимии. Газовые формы соединений фосфора, например, РН3, в его биогеохимическом круговороте почти не представлены. Однако значение фосфора в жизни всех живых организмов очень велико. Без фосфора нарушается состав тканей мозга, скелета, панцирей, энергетика клетки, становится невозможным процесс биосинтеза белка. Соединения фосфора играют огромнейшую роль в жизнедеятельности всех организмов, отдельных экосистем и биосферы в целом. Являясь таким же облигатным биогенным элементом, как углерод, кислород, азот, фосфор вовлекается в биогеохимический круговорот совместно с этими элементами.

Проблема обеспечения растений фосфором может решаться разными путями. Один из них – использование жизнедеятельности почвенных микроорганизмов для повышения усвояемости растениями фосфатов почв и удобрений. Некоторые микроорганизмы, в особенности микоризные грибы и некоторые ризобактерии, способны усиливать поступление фосфора в растение. Бактерии могут использовать две системы повышения концентрации экзогенного фосфата:

— за счет гидролиза органических фосфатов под действием фосфатаз;

— путем растворения минеральных фосфатов за счет продукции кислот.

Еще в начале века было установлено, что некоторые почвенные микроорганизмы способны при наличии доступного органического вещества растворять фосфаты кальция. В разных типах почв микроорганизмы, способные растворять фосфаты кальция, могут составлять 5 – 95% от общей численности микробов, причем корреляция между их количеством в почве и ее механическим составом, кислотностью, содержанием гумуса, азота, фосфора не обнаружена.

Так, изучение почв Приморья показало, что фосфатрастворяющие микроорганизмы были выделены из всех исследуемых почв. Количественно они составляют 13-50% от общей численности, высокая численность фосфатрастворяющих микроорганизмов свойственна только верхним горизонтам. Вниз по профилю она резко падает. Численность микроорганизмов растворяющих железофосфаты, в 4-5 раз больше, чем микроорганизмов, растворяющих алюмофосфаты. Микроорганизмы способны растворять даже такой стойкий фосфорсодержащий минерал, как фторапатит, благодаря образованию органических кислот. Но подкисление не единственный, хотя, по-видимому, главный механизм биологической мобилизации фосфора кальциевых фосфатов.

Большой интерес представляет работа С.И. Воронова (1966), установившего по данным стерильных опытов на кварцевом песке, что мобилизация Р2О5фосфоритов бактериями, растворяющими фосфаты, происходит не вследствие подкисления среды, а является результатом других процессов.

В зависимости от кислотности среды, создаваемой физиологически кислыми солями, происходит накопление углекислорастворимого Р2О5 . Максимальное накопление было отмечено в варианте с сульфатом аммония при наибольшем подкислении среды. С уменьшением кислотности снижается содержание углекислорастворимого Р2О5. Бактерии, растворяющие фосфаты, не изменяют кислотности среды, но способствуют расщеплению фосфорита. За первые 10 дней они усиленно размножались, усваивая растворенный Р2О5 .В этот период наблюдалось резкое снижение Р2О5 , в дальнейшем его содержание резко возросло и через 28 дней достигло 50 мг на 1г фосфорита.

Влияние бактерий на динамику накопления углекислорастворимого Р2О5 отмечено и при нейтрализации среды СаСО3 с доведением рН до 7,3. В период инкубирования заметного изменения рН не наблюдалось, однако, растворение фосфорита было значительным. Так через 21 день содержание Р2О5 достигло – 21,8 мг на 1 г фосфорита, в контроле оно составило – 12,25 мг/1 г.

Существует немало органических веществ, продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, которые связывают кальций сильнее, чем фосфорная кислота. В частности, многие органические соединения (кислоты, сахара) образуют с кальцием недиссоциирующие хелатные комплексы. Если поместить фосфат кальция в раствор такого вещества, то кальций будет им связываться, а фосфор освобождаться и переходить в раствор, который может быть при этом нейтральным и даже щелочным.

Гораздо устойчивее к растворению, чем фосфаты кальция, фосфаты железа и алюминия. В отличие от фосфатов кальция они стойки при умеренно кислой реакции среды. Именно поэтому такие соединения накапливаются в кислых почвах.

В красноземной почве с высоким содержанием окислов алюминия и железа фосфатрастворяющие микроорганизмы (бактерии и грибы) были обнаружены под всеми изученными субтропическими культурами (чайный куст, лавр благородный, мандарин) причем их численность и видовой состав были различны. Наибольшее количество фосфатрастворяющих микроорганизмов обнаружено на мандариновых плантациях.

Микроорганизмы способные к растворению фосфатов полуторных окислов, распространены также в южном и выщелоченном черноземах, лугово-черноземной, серой лесной, дерново-подзолистой почвах Западной Сибири. Результаты опытов показали, что максимальное количество фосфора, которое могло быть в течение 10-24 суток переведено в раствор из фосфата железа (внесено 252 мг Р/л), составило для Neocosmopora vasinfecta — 66,1%, Penicillum luteum – 44,4%, Penicillum purpurogenum – 38,8%, а из такого же количества фосфата алюминия составило для Acpergillus niger – 85,4% и Р.fluarescens – 67,1%.

Зависимость между рН среды и интенсивностью растворения микроорганизмами фосфатов алюминия и железа в этих опытах отсутствовала. В целом ортофосфаты алюминия несколько легче растворялись под воздействием продуктов жизнедеятельности почвенных микроорганизмов, чем фосфаты железа.

По-видимому, для растворения фосфатов железа и алюминия наибольшее значение имеет механизм, основанный на связывании катионов микробными метаболитами. Процесс растворения минеральных фосфатов в почве не имеет специфических “возбудителей” может вызываться деятельностью самых разных представителей почвенных микроорганизмов.

Другая большая группа почвенных фосфатов, малодоступных растениям – органические соединения. Среди почвенных органофосфатов важное место занимает фитин, точнее, соли фитиновой кислоты, в силу их особой стойкости. В 1975 году Муромцевым и Самойловой впервые были описаны микроорганизмы (бактерии и грибы), способные к растворению фитатов кальция, железа и алюминия. Было показано их широкое распространение в почвах СССР, где они составляют от 1 до 50% от общей численности микроорганизмов при выделении на плотной глюкозо-аспарагиновой среде.

При изучении микрофлоры корней пшеницы были обнаружены бактерии, способные использовать фосфор из органических фосфатных соединений. В результате работы было установлено что способностью использовать фосфор из органических соединений обладают представители 14 видов микроорганизмов, но не все штаммы данного вида имеют это свойство. Так, из 8 культур Bacillus agile denitrificans две способны расти на среде без растворимого фосфора; из 7 культур Pseudomonas liquida – одна, из 16 Ps. Radiobacter – 6; из 13 культур Ps. Fluorescens и Ps. Zelinckii четыре; из 8 Chromobacterium denitrificans – 1; Mycobacterium luteum – 1; из двух культур Proactinomyces albicans – 1.

Механизм растворения микроорганизмами ортофосфатов и фитатов по-видимому одинаков. И в том и в другом случаях соли кальция растворяются в первую очередь при подкислении среды, а соли железа и алюминия – в результате конкурентного связывания металлов продуктами жизнедеятельности микроорганизмов. Однако в случае фитатов одного растворения недостаточно – ортофосфат должен быть отщеплен от органической части молекулы инозита. Полученные данные позволили сформулировать концепцию двухфазности микробиологической мобилизации фосфора фитатов, наиболее распространенных органофосфатов почвы:

— первая фаза (неспецифическая) – растворение фитатов кальция, железа, алюминия – весьма сходна с растворением аналогичных минеральных фосфатов и может осуществляться разнообразными микроорганизмами;

— вторая фаза (специфическая) – ферментативное разрушение водорастворимых фитатов с высвобождением ортофосфата. Как показали эти исследования, эта фаза осуществляется в разных почвах (подзолистый чернозем, серозем, краснозем) специфической группой микроорганизмов, среди которых ведущую роль играют Agrobacterium tumefascins и Fusarium sp.

Для оценки эффективности минерального фосфорного питания растений, вышеописанных мобилизующих процессов важно учесть следующее. Свободные минеральные фосфаты (в первую очередь ортофосфаты) активно связываются в почве, и срок их существования там должен быть велик. Соответственно невелики шансы, что эти растворимые фосфаты успевают достигнуть корня, если процесс произошел в некотором отдалении от него. Правда, и в этом случае, замена стойких первичных фосфатов на свежеосажденные – процесс, безусловно, положительный.

Картина радикально изменяется, если эти процессы происходят в ризосфере, активной прикорневой зоне почвы. Здесь действует градиент движения растворенных питательных минеральных элементов из почвы в корень, и есть основание считать, что фосфор, освобожденный ризосферной микрофлорой, может быть использован растениями. Тем более, что в ризосфере сравнительно много доступного для микроорганизмов органического вещества (корневые остатки и выделения), необходимого для осуществления описанных процессов.

Исследователи, изучающие динамику фосфора в почве, стали обращать внимание на связь процессов мобилизации фосфора труднодоступных фосфатов с динамикой содержания органического вещества в почве. Разнообразные органические вещества – продукты жизнедеятельности микроорганизмов, могут образовывать с кальцием, железом и алюминием соединения, более устойчивые, чем фосфаты соответствующих оснований. В этом случае реакция между труднорастворимыми фосфатом и органическим соединением будет идти в одну сторону; с образованием недиссоциирующего органометаллического комплекса и выделением в почвенный раствор эквивалентного количества фосфата.

Такими органическими веществами являются анионы различных карбо- и аминокислот, некоторые сахара, а также гумус и лигнин. Среди наиболее активных анионов отличаются цитрат, тартрат и оксалат, кроме того, на интенсивное растворение фосфатов железа и алюминия оказывают анионы изоаскорбиновой, галловой и муциновой кислот. Эти же анионы, в основном ди-, трикарбоновых кислот (сюда же относятся яблочная и янтарная кислоты), дают трудно растворимые соединения с кальцием.

Если по отношению к рН растворимость фосфатов кальция и фосфатов железа и алюминия в чистых растворах не одинакова, то при взаимодействии с анионами органических кислот между ними обнаруживается большое сходство, а именно, интенсивное растворение в присутствии солей лимонной, щавелевой, винной и некоторых других. С одной стороны, сохраняет свое значение непосредственное воздействие Н+ и ОНионов на фосфат, а с другой рН будет в большей степени определять устойчивость органометаллического комплекса.

Например, при повышении рН с 3,4 до 6,3 растворимость фосфатов железа и алюминия повысилась при взаимодействии с цитратом и понизилась при взаимодействии с тартратом. Это связано с тем, что цитраты железа и алюминия устойчивы при более высоких значениях рН, чем тартраты этих металлов. Отсюда вытекает, что при наличии в среде специфических органических веществ, в частности анионов некоторых органических кислот, растворение фосфатов кальция, железа и алюминия может происходить при любом значении рН, в зависимости от природы образующегося органометаллического комплекса. Это позволяет объяснить процесс растворения фосфатов кальция почвенными микроорганизмами при самых различных значениях рН. Продукты жизнедеятельности бактерий образуют соединения, не диссоциирующие в тех или иных зонах рН, при этом высвобождается соответствующее количество фосфора.

Схематически этот процесс можно представить так:

Ме–фосфат (осадок) + В ® Ме-В (осадок или комплекс) + фосфат,

где В – продукт жизнедеятельности микроорганизмов; образующий с кальцием, железом и алюминием не диссоциирующий комплекс или осадок.

Наибольшее количество фосфата будет переходить в раствор в том диапазоне рН, при котором данное органометаллическое соединение наиболее растворимо.

Широко распространенное, мнение о почве как о субстрате, подобии питательной среды, которую можно заселить любыми микроорганизмами, глубоко неверно. Заселение микробами отдельных участков (как было показано, часто очень мелких) может иметь место в течение непродолжительного времени. Затем вступают в действие регуляторные механизмы, и популяции «пришельцев» оказываются сведенными к минимуму. Настойчивые попытки на протяжении многих лет применить бактеризацию (внесение) почвы микроорганизмами с полезными для растений свойствами (фиксаторов азота, активных минерализаторов фосфорсодержащих веществ) оказались неуспешными, однако практическая важность использования эффективной способности микроорганизмов мобилизовывать многие элементы минерального питания обеспечивают большой интерес к этой проблеме.

До последнего времени исследования мобилизации фосфатов алюминия и железа не проводились из-за отсутствия эффективных методов выделения активных культур. Метод, разработанный Муромцевым и Павловой (1975) открыл широкие возможности для выделения микроорганизмов, растворяющих фосфаты алюминия и железа. Применение этого метода позволило впервые выделить из разных типов почв (дерново-подзолистой, красноземной, сероземной и черноземной) микроорганизмов, способных растворять фосфаты полуторных окислов. Их численность составляет от 1 до 40% от общего количества микроорганизмов, учитываемых при высеве почвенной суспензии на агаризованную глюкозо – аспарагиновую среду.

Действие фосфатмобилизующих микроорганизмов на минеральные частички

В почвах общие запасы фосфора очень малы, 0,1-0.2% Р2О5, и незначительная доля — 10-20% представлена соединениями, относительно доступными для растений, на 50-60% соединениями, малодоступными и на 20-40% соединениями, недоступными для растений. Из всего количества фосфора пахотного слоя почвы 2/3 приходится на минеральные соли ортофосфорной кислоты, а 1/3 – на органические соединения, половина которого представлена фитатами. При высоких урожаях из почв выносится до 50-60 кг Р2О5на га. Поскольку притока соединений фосфора в виде биогенной фиксации из воздуха не существует, большинство фосфорных соединений слабо растворима в почвенном растворе, дефицит этого элемента в почвах и водах суши и океана постоянно ограничивает биологическую продуктивность нашей планеты.

Даже самые лучшие почвы без регулярных внесений фосфорных удобрений через 40-50 лет использования очень сильно истощаются, и урожаи на них падают. Дефицит фосфора в почвах для растений обостряется низкой физиологической доступностью его нерастворимых соединений и особенно необратимой фиксацией в почве самого фосфора, которая достигает зачастую огромных величин, от 500 мг Р2О5 до 1800 мг на 1 кг почвы. Это обстоятельство – основная причина того, что для получения высоких урожаев на полях даются завышенные нормы фосфорных удобрений, на 15-20 кг Р2О5 на га почвы больше, чем его выносится с урожаем.

Как правило, урожаи зерновых выносят только 50-70% от внесенных фосфорных удобрений, при этом 30-50% из них остаются в малодоступной форме в почве. Поскольку этот процесс повторяется из года в год, идет так называемое «зафосфачивание» почв. Фиксация фосфатов почвами бывает настолько полная и необратимая, что даже растворы 0,2-0,5 Н соляной кислоты не извлекают весь связанный фосфор. Сильными фиксаторами и сорбентами анионов фосфорной кислоты являются гидроокислы железа, марганца, алюминия, которые постоянно возникают в природных почвах.

Так, свежеосажденные аморфные полуторные окислы поглощают Р2О5 до 10-13% от веса геля, а ионы РО4 сорбируются точками положительных зарядов кристаллической решетки глинных минералов. В кислых почвах фосфор связывается быстрее, чем в черноземах, обычно в виде фосфатов железа или алюминия низкой растворимости и невысокой физиологической доступности.

Однако, в почве обитают кислотообразующие бактерии, что способствует десорбции фиксированных анионов РО4 , растворению фосфатов и усилению их миграции и выноса в виде растворов. Наиболее доступен бактериям и растениям фосфор органических соединений и гумуса, из которых в процессе минерализации образуются растворимые формы фосфатов в низких концентрациях. Органические кислоты, выделяемые и бактериями, и корнями растений, связывают двухвалентные катионы и подкисляют ризосферу, при этом ускоряются процессы перехода фосфора в обменную форму: НРО43- → НРО42- → НРО4.

Ниже представлены некоторые микроорганизмы, способствующие процессам гипергенеза и высвобождению фосфора в доступное для растений состояние и фотографии изменений частичек породы, вызванные биогенным действием. На рисунке 54 приведена фотография клеток и спор Bacillus megaterium var. Phosphaticum, а на

clip_image016

Рисунок 54 – Клетки и споры Bacillus megaterium var. phosphaticum. Увеличение х20000

рисунке 55 — Спора Bacillus megaterium var. phosphaticum под увеличением в 50000 раз.

clip_image018

Рисунок 55 – Спора Bacillus megaterium var. phosphaticum. Увеличение х50000

Электронные микрофотографии 30-дневного действия бактерий Bacillus mucilaginosus и Bacillus megaterium, мобилизующих фосфор и кремний из неорганического субстрата приведены на рисунках 56 — 65. На рисунке 56 показан контрольный вариант после инкубации с питательной средой без бактерий с увеличением в 300 раз, а на рисунке 57 — то же, но с увеличением 2000 раз. На рисунке 58 — крупная частица руды после 30-дневной инкубации с комплексом бактерий естественного биоценоза, выделенных из серой лесной почвы Томской области под увеличением в 300 раз. На рисунке 59 часть той же частицы под увеличением в 5000 раз.

На рисунке 60 — показан опытный вариант после 30-дневной инкубации гладкой частицы руды с Bacillus mucilaginosus под увеличением в 300 раз, а на рисунке 61 — тот же опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus mucilaginosus но с увеличением поверхности гладкой частицы руды (рисунок 60) в 5000 раз.

clip_image020

Рисунок 56 — Контрольный вариант после инкубации с питательной средой без бактерий. Увеличение х300

clip_image022

Рисунок 57 — Контрольный вариант после инкубации с питательной средой без бактерий. Фрагмент поверхности частицы, изображенной на рисунке 56. Увеличение х2000

clip_image024

Рисунок 58 — Крупная частица руды после 30-дневной инкубации с комплексом бактерий естественного биоценоза, выделенных из серой лесной почвы Томской области. Увеличение х300

clip_image026

Рисунок 59 — Фрагмент крупной частицы руды после 30-дневной инкубации с комплексом бактерий естественного биоценоза,выделенных из серой лесной почвы Томской области. Увеличение х5000

clip_image028

Рисунок 60 — Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus mucilaginosus. Гладкая частица руды. Увеличение х300

clip_image030

Рисунок 61 — Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus mucilaginosus. Поверхность гладкой частицы руды на рисунке 60. Увеличение х5000

На рисунке 62 — опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium. Рыхлая частица руды после разрушающего действия бактерий. Увелич. х500

clip_image032

Рисунок 62 — Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium. Рыхлая частица руды после разрушающего действия бактерий. Увелич. х500

На рисунке 63 показан опытный вариант «изъеденной» после выщелачивания элементов бактериями поверхности частицы руды после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium под увеличением в 2000 раз. Опытный вариант на котором видна рыхлая частица руды после разрушающего действия бактерий после 30-дневной инкубации с Bacillus mucilaginosus под увеличением в 2000 раз приведен на рисунке 64, та же частица руды на рисунке 65 показана под увеличением в 5000 раз.

clip_image034

Рисунок 63 — «Изъеденная» после выщелачивания элементов бактериями поверхность частицы руды. Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium. Увеличение х2000

clip_image036

Рисунок 64 — Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus mucilaginosus. Рыхлая частица руды после разрушающего действия бактерий. Увеличение х2000

clip_image038

Рисунок 65 — Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus mucilaginosus. Фрагмент поверхности рыхлой частицы руды с рисунка 64. Увеличение х5000

 Применение микроорганизмов в качестве живых удобрений

Уничтожение лесов и микоризы, замена бобовых растений злаковыми, разрушение гумусовых горизонтов почв, богатых микрофлорой, сокращение свободных земель – все это сильно изменило биогеохимию азота. На этом фоне нарушений нормального круговорота азота – именно бактериальные удобрения являются могущественным и «экологичным» фактором восстановления устойчивого, на многие годы, баланса различных форм соединений азота в атмосфере и почве.

Внесение минеральных азотных удобрений уже давно является эффективным приемом повышения урожайности агрокультур. Недостатком большинства азотных удобрений является их быстрое окисление до нитратов, которые не сорбируются гумусовым горизонтом почвы и, как правило, вымываются в нижележащие горизонты почвы. Кроме того, их применение ограничивается дороговизной, потерями при транспортировке и внесении в почву, улетучиванием вследствие денитрификации, загрязнением окружающей среды нитратами и окислами азота.

В связи с этим в настоящее время возрастает интерес к биологическому азоту и к проблеме восстановления азотфиксирующей функции почвы после длительной агроэкологической нагрузки. Активно развивающееся в настоящее время биологическое земледелие требует разработки подходов к управлению функционированием микробоценозов, существенно повышающих плодородие почв.

Важный вопрос – каким должно быть соотношение «технического» и биологического азота. Промышленный синтез аммиака из атмосферного воздуха требует очень больших энергетических затрат, несмотря на применение катализаторов, процесс идет при температуре около 500 0С, и давлении – около 300-350 атм. Биологическая фиксация азота – это также энергоемкий процесс, но при этом используется бесплатный источник энергии – солнечная энергия. При этом диазотрофы являются не только источником биологического азота, они еще и окультуривают почву и являются одним из факторов борьбы с эрозией.

Согласно статистическим данным, из трех наиважнейших элементов минерального питания растений – азота, фосфора и калия – наиболее дефицитным является именно азот. Так, при внесении в почву 1 кг азота ожидаемая прибавка урожая в условиях севооборота составляет 16 кг, при внесении 1 кг фосфора – 8 кг, а 1 кг калия — 4 кг .

Придание конкурентоспособности бактериальным препаратам – перспективное направление в разработке «стимулирующих» технологий азотфиксации. Наиболее простой путь к стимуляции азотфиксации – применение агротехнических приемов, позволяющих регулировать работу не отдельных видов диазотрофов, которые не всегда выживают после внесения в почву, а сообществ диазотрофов, обитающих в почве.

Микроорганизмы в сообществах подвержены действию тех же экологических законов, что и другие организмы. Так колонизация почвы микроорганизмами (в том числе не содержащимися в ассоциациях в данном участке) все же ограниченно возможна, если не лимитируется следующими условиями:

— наличием пригодного места в данный момент (в реальных микрозонах обитания микроорганизмов, а не вообще в почве);

— присутствием в достаточном количестве субстрата, обеспечивающего длительное развитие данного организма;

— способностью использовать многие источники энергии и пищи в экосистеме, и причем более эффективно, чем аборигенная микрофлора;

— высокой толерантностью (выносливостью) попадающего организма к микроэкологическим факторам — колебаниям рН и температуры, осмотическому давлению, содержанию кислорода, окислительно-восстановительному потенциалу, влажности и другим, обеспечивающим вегетативный рост;

— наличием механизмов активного воздействия на другие организмы — образованием физиологически активных метаболитов, способностью к антагонизму и устойчивостью к продуктам жизнедеятельности других организмов.

Несоблюдение указанных условий и даже некоторых из них делает невозможным активное поселение микроорганизмов в почве. Более того, как уже отмечалось, входящие в состав ценоза микробы при отсутствии возможностей приспособиться к изменившимся условиям среды выпадают из активного участия в деятельности ценоза, переходя в переживающее состояние.

Каждый вид микроорганизма способен расти, развиваться и размножаться в рамках внешних условий, которые отражают их уровень толерантности или экологическую амплитуду. Эти рамки определены критическими величинами факторов. Отдельные организмы способны существовать при крайних (экстремальных) значениях факторов среды и часто становятся узкоспециализированными — облигатными (обязательными) по отношению к уровню действующего фактора.

Применение азотфиксаторов на практике

Открытие азотфиксаторов привело к созданию так называемых микробных удобрений. Уже в 1895 году Наббе и Хилтнером запатентован препарат микробной культуры Nitragin. Он выпускался в 17 вариантах для различных растений. Препарат представлял собой культуры азотфиксирующих микроорганизмов, смешанных с почвой, торфом, песком, навозом и другими субстратами. Внесение нитрагина в почву или обработка семян назывались инокуляцией и позволяли фермеру повысить качество и количество продукции. В первой половине нашего столетия наблюдался неуклонный рост научно-исследовательских работ по созданию перспективных микробных препаратов для бобовых и не бобовых культур.

Нитрагин — удобрение для бобовых растений. Его готовят из активной специфической для каждого вида растений этого семейства расы клубеньковых бактерий,размножаемых на стерилизованном и богатом органическим веществом субстрате. По действующему стандарту в 1 гнитрагина должно содержаться не менее 70 млн. клеток клубеньковых бактерий для люпина, сои, сераделлы, арахиса и 300 млн. — для остальных бобовых растений.

Однако после второй мировой войны бурное развитие химической промышленности породило надежду на решение многих вопросов технологии выращивания сельскохозяйственных культур с использованием химических удобрений. Начался период химизации сельскохозяйственного производства. Работы по исследованию микробиологических препаратов стали свертываться. Если к середине 40-х годов в мире продавалось 40 тыс. препаратов микробных удобрений, то в 1964 году – всего 1-2 тыс. Возможности большой химии, дешевизна азотных удобрений, простота их использования как бы отодвигали на второй план микробные препараты.

Период переосмысления методов и стратегии использования биологических и химических источников минерального, и, в первую очередь, азотного питания сельскохозяйственных растений наступил в конце прошлого века, когда во многих странах, возникла проблема «экологизации» сельскохозяйственного производства. Постоянно растущие мощности по производству синтетических азотных удобрений и их интенсивное использование кроме положительного эффекта (роста урожайности) несут в себе большую опасность -загрязнение азотсодержащими веществами почвы, подпочвенных вод, рек и озер. Минеральные удобрения вымываются из почвы, выщелачиваются и становятся вредными для человека соединениями – нитритами, нитрозаминами и т.д.

Проблема «занитрачивания» питьевых водоемов вблизи больших площадей сельскохозяйственных угодий, на которых применяют азотные удобрения, требует своего решения как в России, так и во многих промышленно развитых странах. Все это заставляет ученых и практиков искать альтернативные пути решения сельскохозяйственных задач, уделяя серьезное внимание биологической азотфиксации.

В настоящее время спектр применяемых микропрепаратов под бобовые, злаковые и другие культуры довольно широк. В конце XX века во многих странах нитрагенизации подвергается 70-80 % бобовых культур. В районах традиционного возделывания бобовых культур прибавка урожая от применения нитрагина оставляет 2-4 ц/га зерна сои, 1-2 ц/га зерна гороха и люпина, 80-100 ц/га зеленой массы бобовых культур, 6-12 ц/га сена клевера и люцерны. На почвах, где бобовые культуры ранее не возделывались и в которых нет специфичных для них клубеньковых бактерий, дополнительный сбор сельскохозяйственной продукции за счет применения препаратов клубеньковых бактерий достигает 50-100 % и более.

Штаммы ризобий, используемые для инокуляции сельскохозяйственных бобовых культур, обычно выделяются из клубеньков этих же видов. Но данные ряда авторов показывают, что в качестве источника таких штаммов могут быть использованы и некоторые дикорастущие виды бобовых. Так штаммы Bradyrhizobium, выделенные из клубеньков дикорастущего вида Arachis duranensis Benth., превосходят штаммы, выделенные из клубеньков культурного вида A. hypogaea L., по эффективности симбиоза с A. hypogaea. Штаммы R. leguminosarum bv. viceae, выделенные из клубеньков дикорастущих видов Vicia L. в Средней Азии, проявили неменьшую эффективность симбиоза с V. villosa, чем штаммы, выделенные из V. villosa. При этом степень таксономического родства V. villosa и видов – источников штаммов не связана с эффективностью симбиоза, образуемого этим штаммом с V. villosa. Штаммы R. leguminosarum bv. trifolii, выделенные из клубеньков дикорастущих видов Trifolium (T. paucifolium Nutt., T. glomeratum L.), не менее эффективны в симбиозе с культурными видами T. subterraneum L. и T. repens L., чем штаммы, выделенные из этих культурных видов.

Использование препаратов с активными по азотфиксации штаммами ризобий не всегда может дать полную гарантию получения высокого хозяйственного эффекта, так как доминантная роль принадлежит растению, предопределяющему эффект азотфиксации. К тому же высокая продуктивность бобовых при инокуляции штаммами ризобий на Севере тормозится низкими температурами, коротким вегетационным периодом и другими неблагоприятными факторами.

К этим жестким условиям наиболее приспособлены природные популяции штамма Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. Следовательно, в условиях Севера при выращивании традиционных бобовых культур (клевер луговой, клевер красный, астрагал и т.д.) перспективна аналитическая селекция ризобий из дикорастущих видов бобовых. Для относительно «новых» бобовых растений (козлятник восточный, люпин многолистный, донник белый и т.д.) на Севере желательна инокуляция ризобиями, специфичными для «новых» бобовых, так как видоспецифичных для этих культур штаммов ризобий часто в почве нет.

Местные популяции некоторых видов Fabaceae (Medicago sativa L., Pisum sativum L., Phaseolus vulgaris L., Trigonella foenum-gracum L.) весьма изменчивы по активности азотфиксации, осуществляемой при симбиозе с клубеньковыми бактериями, и могут быть использованы в качестве источника исходного материала при селекции этих растений на повышение симбиотической активности.

Таким образом, в условиях Севера (низких температур, pH почвы 4-5, обусловленная Al3+, нерастворимых форм фосфатов в почве, короткого вегетационного периода) перспективна:

1) аналитическая селекция штаммов ризобий из дикорастущих популяций бобовых для инокуляции сельскохозяйственных бобовых;

2) инокуляция культурных растений грибами-зигомицетами из порядка Glomales, переводящими нерастворимые формы фосфатов в растворимые. В частности инокуляция Glomus fasciculatum;

3) совместная инокуляция бобовых ризобиями и Agrobacterium, Arthrobacter;

4) инокуляция злаковых Agrobacterium, Arthrobacter, Flavobacterium.

Азотфиксирующие препараты

Кроме уже упоминавшегося нитрагина, широкое применение нашли и другие азотфиксирующие препараты, среди которых наиболее известен азотобактерин. Азотобактерин, азотоген является бактериальным препаратом, содержащим бактерии азотобактер, способные усваивать атмосферный азот и переводить его в доступное для растений состояние. По действующему стандарту в 1 гпочвенного азотобактерина должно быть не менее 50 млн. клеток азотобактера. Азотобактерин вносят в почву с семенами или обрабатывают им клубни, корни рассады с.-х. культур, не относящихся к семейству бобовых. Азотобактер активно развивается лишь в плодородных, содержащих много органических веществ почвах; улучшает азотное питание и рост растений.

Среди азотфиксирующих организмов современного типа, как правило, используются уже известные представители азотфиксаторов, под различными торговыми марками, часто выделяются определенные виды или штаммы микроорганизмов, обладающие более высокой азотфиксирующей способностью. Иногда предлагаются препараты с неопределенной группой микроорганизмов, как например — бактериальный препарат Ризоторфин. В рекламном проспекте говорится, что бактерии, входящие в Ризоторфин, поселяясь на корнях бобовых растений, образуют клубеньки. Находящиеся в клубеньках микроорганизмы способны фиксировать азот, который находиться в почве в газообразном состоянии, и поставлять этот элемент питания растениям прямо в корень.

Использование Ризоторфина под бобовые культуры заменяет внесение в почву 80-100 кг минеральных азотных удобрений на гектар. Применять Ризоторфин очень просто его наносят на семена перед высевом. Для каждой бобовой культуры подобраны специфичные штаммы клубеньковых бактерий, которые наиболее эффективны на данном растении.

В качестве «живых удобрений» часто используются азоспириллы, которые легко инфицируют корневую систему злаков и других растений. Подобно ризобиям они делятся на виды, колонизирующие преимущественно те или иные сорта злаков, фиксируют азот воздуха, могут продуцировать гормоны роста растений и обладают еще другими свойствами, положительно влияющими на рост и развитие растений.

Действие азотфиксаторов на растение многогранно: возможно, они не столько улучшают азотное питание, сколько усиливают витаминный обмен, продуцируя биологически активные вещества, и способствуют развитию растений, подавляя грибную флору зоны корня вырабатываемыми им фунгистатическими веществами.

Фосфатмобилизирующие препараты

В настоящее время на основе некоторых видов почвенных микроорганизмов создаются “фосфорные биоудобрения”. Наиболее известным среди них является нсфатмобиоизиуются е говорится, чтонизмов, как например высокой азотфиксирующей способностью.и марками, часто выделяются опредфосфоробактерин – препарат, содержащий культуру бактерий, которые переводят труднодоступные соединения фосфора в усвояемую форму (легкорастворимые соли фосфорной кислоты), улучшая фосфорное питание растений. Фосфоробактерин применяется широко, производство его составляет 80% всех видов бактериальных препаратов. Выпускается в сухом виде. Внесение фосфоробактерина дает хорошие результаты только на почвах, богатых органическим веществом (черноземных, торфяных и др.).

Фосфоробактерин — порошок белого, светло-серого или желтоватого цвета, в котором содержатся в большом количестве (8,5 — 16 млрд. в 1 г) споры микроорганизмов, обладающих повышенной способностью переводить фосфорорганические соединения в удобоусвояемую для растений форму. Наиболее эффективен на фоне органических и минеральных удобрений.

Среди других фосфатмобилизирующих культур — штамм бактерий Bacillus megaterium var. Phosphaticum, относяцийся к отделу: Firmicutes, классу: Firmibacteria, семейству: Bacilliacea, роду: Bacillus.

Штамм Bacillus megaterium var. рhosphaticum был селекционирован из лабораторного штамма по оригинальной методике

Объектом исследования служил штамм бактерий отнесенный к роду Bacillus. На основе чистой бактериальной культуры штамма был разработан биопрепарат. Действие препарата основано на способности данных бактерий мобилизовать малоподвижные формы фосфора и делать их доступными для растений. Эффективность препарата проверена в лабораторных условиях и опытах в производственных условиях.

Фосфоромобилизирующий препарат Микофил создан на основе почвообитающего эндомикоризного гриба, который проникает в корень и образует с растением симбиоз. Микофил, прежде всего, обеспечивает питание растений фосфором. Известно, что при внесении в почву минеральных фосфорных удобрений, растения поглощают только 20-25% вносимого фосфора. Остальной фосфор частично вымывается, а большая его часть переходит в нерастворимую форму, которая недоступна растениям. В итоге складывается парадоксальная ситуация, когда в почве накапливается фосфор, приводя к загрязнению грунтов и акваторий, и в то же время растения испытывают фосфорное голодание, т. к. неспособны этот фосфор усвоить.

Микроорганизм, входящий в Микофил, обладает уникальным свойством он способен поглощать фосфор как раз из этих недоступных растению соединений и транспортировать в корень. Таким образом, Микофил обеспечивает поступление в растения фосфора, который накопился в почве за многое годы использования минеральных удобрений и который лежит там мертвым капиталом. Применение Микофила заменяет внесение 80-150 кг фосфорных удобрений на гектар и гарантирует практически полное усвоение растениями поставляемого фосфора.

У микроорганизма, лежащего в основе биопрепарата, есть еще одно полезное свойство он регулирует водный и солевой обмен растений, с которыми образует симбиоз. В результате у растений существенно увеличивается устойчивость к засухе, а также к тепловому и солевому стрессам, что делает Микофил чрезвычайно привлекательным для использования в засушливых регионах. Этот биопрепарат можно применять как под овощные, так и под зерновые культуры, исключение составляют только крестоцветные, с которыми эндомикоризный гриб не образует симбиоз. Следует отметить, что способность Микофила снабжать растения микроэлементами и усиливать устойчивость к водным стрессам повышает приживаемость рассады и саженцев на 50-60%. При использовании биопрепарата прибавки урожая колеблются от 15 до 50% в зависимости от культуры. Применение Микофила под сорго стабильно обеспечивает увеличение урожая на 60-100%.

Кремнебактерин

Кремнебактерин является бактериальным препарат на основе ризосферных микроорганизмов Bacillus mucilagenosus var. siliceous. Систематическое положение: отдел: Firmicutes, класс: Firmibacteria, семейство: Bacilliacea, род: Bacillus.

Bacillus mucilagenosus var. Siliceous, благодаря своим выделениям способны подвергать почвенные силикаты распаду. Микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности, прямо или косвенно, разрушают кристаллические решетки минералов, что является причиной перехода содержащихся в них элементов в подвижное, то есть доступное для растений состояние. Бактерии могут действовать двумя путями: проводить либо ферментативное разрушение кристаллических решеток, либо деструкцию их с помощью микробных слизей.

Например, бактерии Bacillus mucilagenosus выделяют фермент силиказу, который разрушает минералы, и в результате их деструкции высвобождаются минеральные элементы. Выделяющаяся при этом энергия используется бактериями на биосинтетические нужды клетки. Многофункциональный, абсолютно безопасный для человека, оригинальный, длительного действия препарат на основе живых бактерий:

— поставляет обменные формы элементов питания для растений из природных силикатов – неорганических компонентов почвы;

— накапливает биогенный кремний в клеточных стенках растений и упрочняет стебли томатов, перцев, баклажанов, огурцов;

— защищает растения от пониженных температур;

— повышает урожайность овощных и ягодных культур на 15 – 20%.

Бактерии, на основе которых изготовлен кремнебактерин, обладают способностью к слизе- и кислотообразованию, развиваются на частичках минералов, разрушат его и вызывают переход в раствор значительных количеств калия, магния, марганца, цинка, кадмия, кобальта, меди, кремния, алюминия, натрия. Это все потребляется микроорганизмами и лишь после их гибели поступает в распоряжение растений.

Широкие исследования роли кремния в жизни растений ведутся в Китае, Германии, США, Италии, России и, особенно, в Японии, где основной продовольственной культурой является рис, отличающийся исключительно высокой потребностью в этом элементе. С 1955 г. в Японии кремниевые удобрения официально внесены в реестр минеральных удобрений. О возросшем, особенно в последнее десятилетие, интересе к вопросу о роли Si в питании растений свидетельствует проведение международных конференций в США, Японии, России и заметно возросший объем публикаций.

Комплексные микробиологические удобрения

Среди проводимых исследований большой интерес представляет направление по комплексному использованию различных групп микроорганизмов, способных обеспечивать растения не только различными элементами минерального питания, но и защитой от патогенов, веществами, регулирующими развитие. Эти функции выполняют различные представители микробиоты, в том числе внутриклеточные симбионты (эндомикоризные грибы, клубеньковые бактерии), эндофиты тканей надземных и подземных органов (азотфиксаторы Acetobacter, Azoarcus или спорыньевые грибы), а также эктосимбионты на поверхности растений.

Одним из препаратов, широко рекламируемых в последние годы, является группа препаратов под общей маркой ЭМ-технологий. По мнению авторов главной причиной исключительной многофункциональности ЭМ-препарата является широчайший диапазон действия входящих в его состав микроорганизмов. Вот лишь наиболее крупные группы входящих в ЭМ-препарат микроорганизмов и основные выполняемые ими функции.

Фотосинтезирующие бактерии — независимые самоподдерживающиеся микроорганизмы. Эти бактерии синтезируют полезные вещества из корневых выделений растений, органических веществ и ядовитых газов (например, сероводорода), используя солнечный свет и тепло почвы как источники энергии. Полезные вещества включают в себя аминокислоты, нуклеиновые кислоты, другие биологически активные вещества и сахара, способствующие развитию и росту растений. Эти вещества поглощаются растениями непосредственно и также выступают в качестве пищи для развивающихся бактерий. Так, в ответ на увеличение числа фотосинтезирующих бактерий в почве растет содержание других эффективных микроорганизмов. Например, содер­жание микоризных грибков увеличивается из-за доступности азотных соединений (аминокислот), используемых как субстрат, который выделяется фотосинтезирующими бактериями. А микориза, в свою очередь, улучшает растворимость фосфатов в почвах, доставляя, таким образом, растениям недоступный ранее фосфор.

Молочнокислые бактерии вырабатывают молочную кислоту из сахара и других углеводов, произведенных фотосинтезирующими бактериями и дрожжами. Напитки типа йогурта и рассолов производят с использованием молочнокислых бактерий уже очень давно. Молочная кислота — сильный стерилизатор. Она подавляет развитие вредных микроорганизмов и ускоряет разложение органического вещества. Кроме того, молочнокислые бактерии способствуют разложению лигнинов и целлюлозы и ферментируют эти вещества.

МК бактерии способны подавить распространение вредного микроорганизма, вызывающего болезни растений. Увеличение численности ослабляет растения, что вызывает развитие других болезней и часто заканчивается вспышкой нематод. Численность нематод падает по­степенно, по мере того, как бактерии молочной кислоты подавляют распространение Fusarium.

Дрожжи синтезируют антибиотические и полезные для растений веще­ства из аминокислот и сахаров, продуцируемых фотосинтезирующими бакте­риями, органическими веществами и корнями растений. Биологически активные вещества типа гормонов и ферментов, произведенные дрожжами, стимулируют точку роста и, соответственно, рост корня. Они секретируют (выделяют) полезные субстраты для эффективных микроорганизмов типа молочнокислых бактерий и актиномицетов.

Актиномицеты, которые по своему строению занимают промежуточное положение между бактериями и грибами, производят антибиотические вещества из аминокислот, выделяемых фотосинтезирующими бактериями и органическим веществом. Эти антибиотики подавляют рост вредных грибов и бактерий. Актиномицеты могут сосуществовать с фотосинтезирующими бактериями. Таким образом, обе группы улучшают состояние почвы.

Ферментирующие грибы. Грибы типа Aspergillus и Penicillium быстро разлагают органические вещества, производя этиловый спирт, сложные эфиры и антибиотики. Они подавляют запахи и предотвращают заражение почвы вредными насекомыми и их личинками.

Каждая разновидность эффективных микроорганизмов (фотосинтезирующие бактерии, молочнокислые бактерии, дрожжи, актиномицеты, грибы) имеют собственную важную функцию, но при этом, с одной стороны, поддерживают действие других микроорганизмов, с другой — используют вещества, произведенные этими микроорганизмами. Это явление «сосуществования и сопроцветания» и есть симбиоз. Когда эффективные микроорганизмы развиваются в почвах как сообщество, количество полезных микроорганизмов увеличивается. Микромир почвы становится богаче, и микробные экосистемы в почве хорошо сбалансированы, причем определенные микроорганизмы, особенно патогенные, не развиваются. Таким образом, подавляются болезни почвы. Корни растений выделяют вещества типа углеводов, аминокислот, органических кислот и активных ферментов. ЭМ используют их для роста. В течение этого процесса они, в свою очередь, выделяют и тем самым обеспечивают растения аминокислотами, нуклеиновыми кислотами, разнообразными витаминами и гормонами. Кроме того, ЭМ в околокорневой зоне образуют симбиоз с растениями. Следовательно, в почвах, заселенных ЭМ, растения развиваются в исключительно благоприятных условиях.

Исходя из имеющихся сведений об экологии микроорганизмов, частично изложенных в данном пособии, нужно с известной долей скептицизма относиться подобным рекламам и проводить предварительные исследования в конкретных почвенно-климатических условиях перед их широким внедрением. Однако работы, проводимые в данном направлении, представляют большой интерес и имеют огромные перспективы при переходе на так называемое «органическое земледелие».

Важно отметить, что производство микробных «удобрений» не только возможно, но и необходимо организовать непосредственно в регионах с использованием наиболее активных представителей аборигенных форм симбионтов. На рисунке 66 показан общий вид биокультиватора «УИС-0.25» для масштабирования жидких культур микроорганизмов, с помощью которого возможно производство микробиологических препаратов в объемах достаточных для крупных регионов.

Некоторые методики по выделению и поддержанию чистых культур приведены в приложении Г, там же показаны способы проверки активности культур. Организация рабочего места микробиолога и способы работы с почвенными микроорганизмами описаны авторами в пособии «Микроорганизмы и биогеохимический потенциал».

clip_image039

Рисунок 66 — Общий вид биокультиватора «УИС-0.25» для масштабирования жидких культур микроорганизмов

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *